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Laura1988
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
 Inserito il - 19 maggio 2011 : 19:11:24
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Ciao a tutti, mi chiamo Laura e sto facendo la tesi sperimentale di specialistica a genetica molecolare. Questa settimana io e la mia collega abbiamo fatto una mutagenesi doppia, utilizzando il kit Quickchange II site-directed mutagenesis. Nel controllare il prodotto di amplificazione, mediante elettroforesi in gel agariosio 1%, ci siamo accorte che invece di ottenere bande ben definite (di dimensioni sostanziose), erano presenti degli smears.
Qualcuno a qualche idea su cosa possa essere accaduto?
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domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
 Inserito il - 19 maggio 2011 : 23:50:47
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Perchè avete fatto un'elettroforesi?!
In quel kit c'è l'enzima dpnI che digerisce il filamento parentale, quindi vedete uno smear. Dopo la PCR va aggiunto DpnI e poi trasformati batteri. Non mi pare che nel protocollo ci sia l'elettroforesi. |
Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato... |
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Laura1988
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
Inserito il - 20 maggio 2011 : 09:57:57
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No infatti, non è da protocollo, è stato aggiunto dalla professoressa. Anche io avevo pensato all'azione di dpn1, però in teoria non è una endonucleasi di resizione, quindi digerisce il parentale dove trova la metilazione. Uno smear come quello ottenuto sembra più simile all'azione di una ER, che di dpn1. Magari mi sbaglio io però!
É la prima volta che faccio una elettroforesi dopo l'amplificazione, con questo protocollo, quindi sinceramente non sapevo nemmeno cosa aspettarmi, ma mi dicono in lab. Che fosse più plausibile ottenere una banda, che uno smear! |
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domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 21 maggio 2011 : 15:42:22
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A parte il fatto che concordo ovviamente con Domi!
Citazione:
Messaggio inserito da domi84
Mmm...DpnI è un'endonucleasi di restrizione http://www.neb.com/nebecomm/products/productr0176.asp
ma esattamente l'elettroforesi quando l'hai fatta?
Andrebbe fatta prima di digerire il DNA plasmidico con DpnI, non dopo!
C'è scritto anche sul protocollo.
N.B. Nota che si scrive DpnI e non 1!
Comunque sposto la discussione nella sezione di "Biologia Molecolare" che mi sembra più adatta.
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