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Ithink
Nuovo Arrivato
1 Messaggi |
 Inserito il - 17 dicembre 2013 : 02:09:24
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Ciao a tutti!
Creo una nuova discussione perché le precedenti mi sembrano essere più teoriche che pratiche!
Sono alle prese con una mutagenesi complicata: la sostituzione da produrre é singolo amminoacidica, quindi non troppo problematica, se non fosse che il gene in questione é terribilmente ricco in GC.
Le colonie crescono, ma la mutazione non si introduce!
Sto utilizzando la Phusion HF della Thermoscientific:quindi (come da sheet) sto denaturando a 98 gradiC (denaturazione iniziale 3 minuti, vista la quantità di GC) e ho provato con un extension di 1min/kb (le mie sono circa 6 kb, trattandosi di vettore con gene inserito).Ho un po' di dubbi sul numero di cicli da utilizzare, per il momento ho tentato 18, (forse sono pochi?) e forse anche la Tannealing si potrebbe modificare (la Tmelting ê parecchio alta, intorno a 66gradiC). Qualcuno ha esperienza di mutagenesi con questo enzima e/o può darmi qualche consiglio?
Grazie in anticipo!!
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domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
 Inserito il - 17 dicembre 2013 : 21:07:15
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Phusion HF della Thermoscientific
Le taq hanno di solito una dimensione massima di amplificato che riescono a sintetizzare, questa taq ci riesce a fare 6kb?
Hai disegnato bene il primer? Io in passato ho utilizzato questo servizio:
http://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp
Citazione:
Ho un po' di dubbi sul numero di cicli da utilizzare, per il momento ho tentato 18
Quando la facevo io 12 era il minimo di cicli (per 1 nt di mutazione), 18 il massimo (per >4 nt)
L'enzima DpnI è buono? funziona bene? Trasformi solo 1 ul di questa preparazione digerita? |
Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato... |
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AleXo
Moderatore
Prov.: Estero
Città: San Francisco, California
1550 Messaggi |
Inserito il - 17 dicembre 2013 : 22:13:34
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| hai considerato comprare il gene sintetico o almeno i geneart strings (o prodotti similari)? Ormai non costano quasi niente e sono + efficienti di perdere tempo e reagenti. |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 18 dicembre 2013 : 17:38:03
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Innanzitutto, dato che si tratta di un templato ricco di CG, hai utilizzato il buffer CG anziché il buffer HF?
Secondo, devi sostituire un singolo aminoacido ok, ma è una mutazione puntiforme (singola base) o devi mutagenizzarne di più?
Come hai disegnato il primer mutagenico? Potrebbe essere quello il problema.
Riguardo ai cicli, sì 18 potrebbero essere pochi, per una efficienza ottimale ne raccomandano 25!
Dopo la PCR hai verificato l'amplificato? Dovresti valutare la banda da lì.
Mi sembra veramente strano che ti crescano delle colonie non mutagenizzate, l'efficienza è in genere molto alta e quelle non mutagenizzate (che derivano dal templato che ti porti dietro) sono in genere veramente pochissime.
Infine non hai detto da quanto templato sei partito, dovresti partire da 10pg in un volume di PCR 50ul.
66°C non è poi così alta come temperatura di annealing per la Phusion, come l'hai calcolata? Hai usato il loro calcolatore, lo sai che la Ta è più alta di quella che si usa con la Taq?
Poi non so se tu stia usando la Phusion e basta o hai preso il kit di mutagenesi, è esattamente la stessa cosa nel kit ti forniscono anche la ligasi e il plasmide di controllo con i suoi primers, niente di fondamentale! Ma quello che ti può essere utile, nel caso tu non l'abbia già, è il protocollo che mettono nel kit, che trovi benissimo on line, è questo: http://www.thermoscientificbio.com/uploadedFiles/Resources/tech-manual-f-541-phusion-site-directed-mutagenesis-kit.pdf
se hai altri dubbi chiedi pure.
@Domi: giusto per conoscenza.
L'enzima in questione è una polimerasi proof reading, non una Taq.
Può amplifcare tranquillamente fino a 10KB, quindi 6 ci stanno benissimo.
Non si utilizza l'enzima DpnI, è un tipo di mutagenesi diversa. Si amplifica tutto il plasmide per PCR mutagenizzandolo, poi si liga per ricircolarizzarlo e si trasforma.
Si usa "poco" templato e "tanti" cicli in modo che il prodotto mutagenizzato sia molto di più rispetto al templato originale non mutagenizzato. |
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