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biotecman
Nuovo Arrivato
40 Messaggi |
 Inserito il - 24 gennaio 2008 : 21:16:15
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sn nuovo del forum e avrei una piccola domanda sull'analisi dell'espressione genica di un determinato trascritto tramite northern.
Immaginiamo di aver estratto un campione di mRNA da un tessuto muscolare e un'altro da tessuto epatico.
Effettuiamo il northern blotting su entrambi i campioni usando ad esempio una sonda per il trascritto p53. Prima di paragonare le intensità delle bande ottenute dobbiamo normalizzare il tutto con un controllo endogeno (quindi ibridiamo gli stessi campioni con una sonda per un trascritto costitutivamente espresso quale ad esempio l'actina).
Sono assolutamente daccordo con questa procedura ma perché non si dosano direttamente spettrofometricamente i due estratti di RNA a 260 nm e quindi si pipettano sul gel gli stessi microgrammi di RNA per poter paragonare direttamente le intensità delle bande dopo ibridazione??
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 24 gennaio 2008 : 21:55:07
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Perchè è meno preciso. Ad es. potresti avere contaminanti che assorbono a 260 oppure potrebbe andare storto qualcosa nei passaggi successivi.
Usando un'altra sonda invece, non solo usi la stessa metodica di rilevazione, ma hai anche il vantaggio di vedere piccole differenze tra i vari campioni che probabilmente ti sfuggirebbero con una lettura spettrofotometrica.
edit: ad ogni modo, quando facevo western blot io facevo entrambe le cose. Lettura allo spettrofotometro per caricare (più o meno) la stessa quantità di proteine + controllo interno per normalizzare. In generale le bande di actina avevano intensità simile, ma c'era comunque un po' di variazione tra i vari campioni. |
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biotecman
Nuovo Arrivato
40 Messaggi |
Inserito il - 24 gennaio 2008 : 21:58:28
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e tutta una questione di precisione allora..pensavo che le ratio A260/A280 e A260/230 abbastanza elevate garantissero un buon livello di purezza
cmq grazie mi stavo scervellando inutilmente!! |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 24 gennaio 2008 : 23:56:32
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Citazione:
pensavo che le ratio A260/A280 e A260/230 abbastanza elevate garantissero un buon livello di purezza
Beh, una cosa è la precisione ed un'altra è la purezza.
In effetti puoi vedere se hai contaminanti nel tuo campione, e quindi puoi escludere quel problema. Tuttavia il segnale del Northern è quantitativamente più preciso di quello dello spettrofotometro, e soprattutto visto che i tuoi dati sono ottenuti col northern è buona cosa usare la stessa tecnica anche per misurare lo standard, in modo da avere risultati comparabili.
Un esempio che mi viene in mente:
hai 2 gruppi di cellule, un gruppo di controllo ed uno trattato con il farmaco X.
Estrai l'RNA e vai a fare un northern per misurare l'espressione del gene A.
Misuri allo spettrofotometro per caricare la stessa quantità di campione e poi fai il northern.
La banda di A nel trattato è più debole di quella nel controllo.
Concludi che il tuo farmaco diminuisce la trascrizione di A.
Tuttavia se tu avessi usato l'actina avresti visto che A non diminuisce la trascrizione di A. Perchè?
Ad esempio se A aumenta molto la trascrizione di altri geni (ad esempio della stessa actina) quando vai a misurare allo spettrofotometro non misuri solo A, ma anche gli altri mRNA! Quindi vai a caricare la stessa quantità di RNA totale, ma in proporzione meno A, anche se la trascrizione di A non è stata modificata! |
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tommasomoro
Utente Junior
358 Messaggi |
Inserito il - 25 gennaio 2008 : 10:04:07
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questi dati sono sempre da prendere con le pinze
e' per questo che molto spesso si fanno curve dose/riosposta
o stimolo/risposta etc etc
T. |
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biotecman
Nuovo Arrivato
40 Messaggi |
Inserito il - 25 gennaio 2008 : 11:20:42
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grazie chicK80!!
il tuo esempio sul farmaco X mi ha chiarito davvero molto tutta la questione!!! |
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Didattica
