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Donni
Nuovo Arrivato
1 Messaggi |
 Inserito il - 23 febbraio 2019 : 18:44:14
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Ciao a tutti,
sono nuova di questo forum (mi sono iscritta proprio oggi) ma lo consulto spesso per trovare risposte ai miei problemi scientifici. Sono una dottoranda ed in questo momento avrei bisogno di qualche consiglio sul clonaggio. Il mio problema č questo: avevo un clone che tuttavia si esprimeva poco (la relativa proteina era una flebile banda sul gel sds!) per cui mi č stato consigliato di spostarlo in un un altro vettore. Ho sottoposto il clone a taglio enzimatico, purificato il frammento e l'ho utilizzato per la ligation. In seguito a trasformazione, ho ottenuto colonie su piastria e le ho proceduto con lo screening. Ho fatto una colony pcr usando i primer dell'inserto e un'altra usando i primer del vettore. In entrambi i casi ho ottenuto la banda del peso atteso. A questo punto, dopo aver fatto una miniprep, prima di mandare a sequenziare (nel nostro lab abbiamo qualche problemino con la ditta dei sequenziamenti!) volevo procedere con l'analisi di restrizione dell'ipotetico nuovo clone. Ho proceduto con il taglio enzimatico ma, non solo non ho nemmeno l'ombra del frammento (375 bp) ma sembra anche che ci siano due bande ad alto peso molecolare che reputo essere il vettore.
Mi sembra molto strano che il taglio enzimatico non sia avvenuto visti i precedenti risultati. Qualcuno di voi ha qualche suggerimento?
Grazie mille
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Geeko
Utente
Cittā: Milano
1043 Messaggi |
Inserito il - 24 febbraio 2019 : 11:16:12
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| Senza l'idea della mappa del plasmide finale č difficile dare consigli pratici e utili. Di solito la cosa ideale da fare come digestioni analitiche sarebbe ricontrollare con gli stessi enzimi usati nel clonaggio che i siti ligati si siano riformati correttamente. Soprattutto poi, se possibile, usare un enzima che tagli sia internamente che esternamente all'inserto, preferibilmente che generi frammenti ben distinti a seconda dell'orientamento dell'inserto. Nel tuo caso per vedere un frammento di 375 bp dopo digestione immagino tu abbia caricato abbastanza DNA nel gel, altrimenti pur essendoci il frammento non riusciresti a vederlo. Per far un esempio pratico: se il tuo vettore č di circa 4kb e il tuo inserto č di 0.4kb, per poter visualizzare comodamente quest'ultimo dovrai caricare 10 volte il quantitativo di DNA plasmidico che di solito carichi per visualizzare lo stesso plasmide integro. |
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Analisi di restrizione dei plasmidi ricombinanti
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