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selenaddict
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 Inserito il - 28 aprile 2015 : 12:16:02
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ciao miei cari
ho un protoccolo di immunofluorescenza per rilevare ibridi DNA-RNA, vado dritta al punto: questo protocollo è buono e permettere di vedere le strutture di interesse che ricadono dentro il nucleo e quindi permette di vedere un buon segnale nucleare; il problema è che alcune volte il segnale nucleare non si vede per niente e al suo posto compare un grosso segnale perinucleare (probabilmente mitocondriale); dal momento che questo è accaduto diverse volte sia a me che a miei colleghi vorrei sottoporvi il protocollo (che sembra essere buono) per capire come e quali step possano essere andati storti e perché...di fatti al mio secondo tentativo l'esperimento è andao decisamente bene ma non riesco a capire la variabile che cambia;
le cellule seminate su slide 24 ore prima vengono sottoposte a un trattamento farmacologico (non vado nel dettaglio ma non interferisce con la visualizzazione dei miei ibridi)
appena terminato il tempo di trattamento le cellule vengono:
- lavate con PBS rapidamente per togliere residui di fenolo/DMEM
-immerse in metanolo 100 per 10 min a Temperatura ambiente (con il metanolo a -20°) per fixing e permeabilizzazione
-lavaggio in PBS
-immersione in acetone per 1 min per permeabilizzare ulteriormente
-infine 3 lavaggi in PBS e il giorno dopo verranno sottoposte alla preparazione per microscopio a fluorescenza
questa preparazione consiste in
-Block Buffer per 30 min
-incubazione Ab primario (2h) senza agitazione
-3 lavaggi in SSC4X in agitazione (5 min l uno)
-incubazione Ab secondario (1h)
-DAPI staining
-montaggio su porta oggetto
ora il nostro sospetto è che sia andato storto qualcosa nella fase di fixing e permeabilizzazione, qualcuno ha delucidazione su come funzionano metanolo e acetone sulle cellule seminate su slide?
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