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aua
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7 Messaggi

Inserito il - 21 luglio 2016 : 19:04:57

Scritto da MolecularLab Mobile

Ciao, ho bisogno del vostro aiuto.
Sto cercando di mettere a punto una real time-pcr, ma senza successo.
Avrei due 'grandi' quesiti da porvi:
1.quanto RNA retrotrascrete a cDNA e quanto cDNA usate nella real time? Io ho retrotrascritto 100ng di RNA: forse è poco!
2.usando il sybergreen, quali temperature di annealing e extention usereste (i primers hanno TM tra 60-62¤C)? Io ho usato protocollo descritto nella brochure del sybergreen, ovvero real time bifasica: 95¤C denaturazione e 62¤C annealing.
Spero qualcuno possa aiutarmi.. non ne esco più!
Grazie

Jackie
Nuovo Arrivato

2 Messaggi

Inserito il - 02 agosto 2016 : 11:38:19

Ciao! in genere io ho sempre retrotrascritto 1000ng se ne avevo ovviamente.. altrimenti fino ad un minimo di 400ng..
i cicli che noi utilizziamo sono questi:
- 2 minuti a 50°C;
- 10 minuti a 95°C;
- 15 secondi a 95°C, per 45 cicli;
- 1 minuto a 60°C.
spero di esserti stata di aiuto!