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caro9116
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
 Inserito il - 14 ottobre 2014 : 22:25:18
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Ciao a tutti! Sono nuova e sto ancora imparando ad usare il forum, spero di postare la domanda nella sezione giusta!
Vi contatto perché mi sto occupando di real time PCR su DNA mitocondriale; come reagente usiamo il SYBR GREEN. Ho trovato i primer adatti, adesso dovrei creare una curva standard a cui rapportare i diversi campioni che devo analizzare. Da questi dati poi dovrei riuscire a calcolare le copy numbers mitocondriali di ogni campione che andrò a testare. In laboratorio abbiamo una macchina nuova, la StepOne della Applied Biosystem, ma nessuno qui la ha mai usata per fare Real Time. Inoltre, io avevo usato TaqMan, mai Sybr green, e tutti gli esempi che ho trovato anche sul manuale sono fatti con TaqMan.
Ho letto il manuale e ho provato a impostare la macchina: ho provato una diluizione 1:5 per gli standard e ho usato i volumi che mi ha calcolato la macchina, quindi in teoria dovrebbero essere giuste. In tutto il volume finale è 20 ul, ho inserito la concentrazione iniziale del campione di DNA che ho valutato con il nanodrop per preparare gli standard e mi han detto di provare a usare come "campione sconosciuto" del DNA alla concentrazione di 50ng/ul.
Guardando il manuale (che porta esempi solo con TaqMan), la retta risultante dovrebbe contenere tutti i punti corrispondenti agli standard, ma la mia ne comprende solo 1! Gli altri punti mi compaiono sparsi nel piano oppure non mi compaiono proprio. Ho fatto gli standard in doppio e i due replicati sono uno sopra e uno sotto la linea.
Io non ho mai fatto curve standard e non ho idea di cosa possa aver sbagliato! Qualcuno mi sa dare una mano?
Grazie in anticipo!!!
Carola
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picchiasebino
Nuovo Arrivato
Città: roma
52 Messaggi |
Inserito il - 15 ottobre 2014 : 16:47:15
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Proviamo: non mi è chiaro come hai creato i punti standard: cosa vuol dire "ho usato i volumi che mi ha calcolato la macchina"? Solitamente la diluizione seriale dello standard si fa manualmente prelevando una quota di soluzione DNA e si diluisce (nel tuo caso 1:5) in altra provetta fino a fare tante diluizioni quanti sono i tuoi punti standard (non meno di tre). In questo modo il volume di caricamento dei DNA std è uguale per tutti e si evitano molti errori di misura. I pozzetti caricati a std andranno selezionati sulla macchina come tali (Standard e non Unknown) e indicato il quantitativo (ng, %, copie, ecc).
Vediamo se fino a qui ci siamo.
Hai impostato un profilo termico degli step per un SYBR e non per un Taqman?
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caro9116
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
Inserito il - 15 ottobre 2014 : 17:52:02
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In effetti forse non mi sono spiegata bene: in questa macchina mi basta inserire le concentrazioni iniziali e la diluizione (es: 1:5) e mi calcola automaticamente i volumi da aggiungere. Ad esempio: partendo da un campione alla concentrazione di 437.1 ng/ul e volendo un volume finale di 20 ul con il 15% di eccesso mi dice di aggiungere 8.9 ul di acqua e 1.1 di DNA; per la seconda diluizione mi dice di aggiungere 9 ul di acqua e 1 ul della diluizione precedente e così via (non so se mi sono spiegata meglio). Poi ovviamente devo farla io manualmente, ma i volumi me li calcola lei. Fin qui credo che siamo d'accordo!
Sul protocollo da usare mi hai messo un dubbio: Io ho cercato un po' e alla fine ho deciso di usare: Stage 1: 50° x 2 minuti, 95° per 10 minuti. Stage 2: 95° per 15 secondi 60° per 1 minuto. Melt curve: 95° per 15 secondi 60° per 15 secondi. il tutto per 40 cicli. Come ho detto non sono un'esperta di curve standard... il protocollo secondo te va bene?
Grazie per l'aiuto!  |
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picchiasebino
Nuovo Arrivato
Città: roma
52 Messaggi |
Inserito il - 15 ottobre 2014 : 18:03:49
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| Ti consiglierei di vedere bene i protocolli per il SYBR, quello che mi hai descritto tu sembra un classico per taqman. Per il SYBR andrebbe anche bene ma manca lo step finale a 95° con raccolta di dati dove puoi vedere e analizzare la curva di melting. Non conosco la Step One. Spero che altri utenti possano intervenire per aiutarti |
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caro9116
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
Inserito il - 15 ottobre 2014 : 18:26:23
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ok cercherò meglio, grazie mille per il tuo aiuto!  |
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