Quanto č utile/interessante questa discussione:
| Autore |
Discussione |
|
|
aivlis899
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
 Inserito il - 05 aprile 2014 : 12:35:32
|
Ciao a tutti!!! Sono una studentessa di biotecnologie e sto preparando la mia tesi magistrale in un laboratorio all'estero.. Nel mio progetto di tesi č prevista la produzione e purificazione dell'istone H2B necessario per il riassemblaggio dell'ottamero istonico e poi per il saggio di ricostituzione del nucleosoma. Devo eseguire la produzione e la preparazione dei corpi di inclusione, nonchč lo step successivo di purificazione seguendo il protocollo di Luger e Dyer. Ho eseguito una volta la preparazione dei corpi di inclusione ma ho fallito. Ho di nuovo prodotto la proteina, ed ho congelato la sospensione cellulare in accordo al protocollo. Il mio problema č che č solo la seconda volta che mi appresto a fare questo e nessuno me lo ha mostrato prima, quindi vado per tentativi. Tuttavia, devo assolutamente riuscire ad ottenere i corpi di inclusione per passare allo step della purificazione dato che č necessario per andare avanti nel mio progetto. Allego il protocollo di Luger e Dyer. Il mio dubbio č, devo aggiungere il lisozima in ogni caso oppure soltanto se la sospensione non sembra idoneamente viscosa???
Protocol for Inclusion body preparation
1. Lyse cell suspension by thawing at 37° C.
2. Pour cell extracts into 250ml centrifuge bottles. At this point, the cells should be very viscous. If the cell suspension is still watery, then full lysis has not occurred. In this case, or if no pLysS plasmid has been present, add lysozyme to a concentration of 1 mg/ml and incubate on ice for 30 minutes. Repeated freeze-thaw cycles also facilitates lysis. Bring total volume to 100 ml.
3. Blend cell extracts with tissumizer to reduce viscosity. Blend until viscosity is reduced; avoid over-heating of sample. A sonicator can also be used with similar results.
4. Spin for 20 minutes at 4°C at 12,000 g. Pour off the supernatant, and resuspend the tight, solid pellet with 75ml of wash buffer containing 1% Triton X-100. If the pellet is spongy, sonicate / tissumize again. Spin for 20 minutes as before.
5. Repeat once as above, and once with wash buffer without Triton X-100. The drained pellet can be stored for a limited time at -20.
Dubbi:
1 -bisogna portare la sospensione a 100 ml..100 ml di Wash buffer??? Non č menzionato ne prima ne dopo... ma suppungo di si..
2- devo aggiungere il lisozima in ogni caso oppure soltanto se la sospensione non sembra idoneamente viscosa???
3 -Il pellet che ho ottenuto l'altra volta non era "spongy" e non rimaneva attaccato alla parete del tubo che avevo usato per centrifugare, sebbene il pellet c'era, appena ho iniziato a versare il supernatante il pellet letteralmente ci galleggiava dentro. Peraltro, nel laboratorio in cui sto non c'č il Tissumizer ma solo il sonicatore o l'ultrasonicatore che come menzionato nel protocollo sono una valida alternativa. Io ho usato questo e peraltro non č menzionato alcun intervallo nella ripetezione delle sonicazioni, nč per quanto tempo, nč quanto devo aspettare tra una sonicazione e l'altra.. Quindi mi sono arrangiata e ho seguito questi passaggi valutando di volta in volta in modo alquanto empirico ( salvo il fatto che non ho alcuna esperienza a riguardo!!). Qualsiasi suggerimento č benvenuto. Mi affido a voi. Chiunque abbia dimestichezza con questo genere di protocollo puņ svelarmi qualche troubleshooting per aiutarmi nella buona riuscita di questo esperimento?? Grazie mille in anticipooo
Dank vell a tutti 
|
|
|
|
| |
Discussione |
|
|
|
Quanto č utile/interessante questa discussione:
| MolecularLab.it |
© 2003-18 MolecularLab.it |
 |
|
|
preparazione corpi di inclusione per il 
Didattica
