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Discussione

immetella
Nuovo Arrivato

Prov.: Pescara
Citt�: Pescara

32 Messaggi

Inserito il - 07 settembre 2011 : 11:20:23

Buongiorno a tutti!
Stamattina il mio capo mi ha detto che per velocizzare un progetto che stanno facendo devo dare una mano e dil mio ruolo consisterebbe nell'estrarre RNA da alcune cellule, retrotrascrivere l'RNA in cDNA e poi sequenziare il gene che a loro interessa controllare (con un sequenziatore automatico).
La mia domanda � semplice: poich� mi daranno le sequenze di una coppia di primers da ordinare...posso usare gli stessi primers sia per sintetizzare il secondo filamento del cDNA che per sequenziare?...forse � una domanda banale ma il mio cervelo oggi proprio non ci arriva!

grazie mille a chi risponder�!

giulella
Nuovo Arrivato

38 Messaggi

Inserito il - 07 settembre 2011 : 15:45:56

Teoricamente potresti, ma in genere lo evito perch�, in base alla mia esperienza, ho notato che non ottengo mai la sequenza completa (mi manca sempre quella del primer e quella che viene subito dopo). E' come se il sequenziatore non inizia a leggere la sequenza immediatamente dopo il primer...

In ogni caso, � preferibile clonare l'inserto in un plasmide e sequenziare con dei primer presenti nel plasmide...in questo modo sei sicura di avere la sequenza completa!

immetella
Nuovo Arrivato

Prov.: Pescara
Citt�: Pescara

32 Messaggi

Inserito il - 07 settembre 2011 : 15:50:25

Credo che mi faranno sequenziare direttamente così senza clonare l'inserto poichè hanno davvero fretta di avere questa info! Se poi ci saranno problemi proporrò il clonaggio, ti ringrazio molto per la risposta!

cami
Utente Junior

Citt�: roma

136 Messaggi

Inserito il - 12 settembre 2011 : 11:09:19

ciao! anche io uso gli stessi primers per amplificare e per sequenziare... quello che dice giulella � giustissimo, puoi ovviare al problema facendo partire il sequenziamento prima dal 5' e poi dal 3' del tuo cDNA, e poi ricostruisci la sequenza delle parti che mancano (cio� quelle vicine al primer, che in genere vengono confuse..)