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ioeleme
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 Inserito il - 18 febbraio 2019 : 10:58:31
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Buongiorno a tutti,
da un mesetto ormai sto cercando di ottimizzare delle trasfezioni con siRNA fluorescenti su cheratinociti corneali. Il reagente trasfettante usato è la Lipofectamina RNAiMAX della ThermoFisher. Purtroppo però, non riesco ad apprezzare la trasfezione nè al microscopio a fluorescenza nè al microscopio confocale, risultando come un'avvenuta trasfezione.
Nella speranza che qualcuno trovi degli errori da segnalarmi o abbia qualche suggerimento da darmi, riporto di seguito il protocollo di trasfezione da me utilizzato.
Transfection experiment with Lipofectamine RNAiMAX and siRNA FITC (by Invitrogen) in healthy oral mucosa cells
Piastrare le cellule della mucosa orale in 9 pozzetti di una MW24, con 20.000 cellule per pozzetto.
Le cellule dovranno essere trasfettate al raggiungimento di circa il 70% della loro confluenza (ovvero quando le colonie non sono ancora fuse fra loro, ma si presentano ben separate).
Venerdì #8594; piastrare cellule in KM-
Lunedì #8594; cambiare terreno ed aggiungere KM+
Mercoledì/Giovedì #8594; cellule pronte per la trasfezione
Prima della trasfezione, è necessario rimuovere il KM+ e lavare le cellule un paio di volte con DMEM 0%, infine lasciare 500#956;l di DMEM 0% in ogni pozzetto.
Diluizione del siRNA FITC
Soluzione madre siRNA FITC = 20#956;M
Per trovare la condizione migliore, verranno testate 3 concentrazioni:
CF1 = 50nM CF2 = 75nM CF3 = 100nM
3 pozzetti per condizione #8594; Volume di siRNA FITC x well = 50#956;l
VF x well = 600#956;l
Diluizione della Lipofectamina RNAiMAX
Mescolare gentilmente la soluzione e diluire 1:50 in DMEM 0%, calcolando un volume totale per 10 campioni (9+1 in più); 50#956;l x well, 500#956;l tot = 10#956;l Lipofectamina + 490#956;l DMEM 0%.
Mescolare siRNA FITC e Lipofectamina RNAiMAX
Mescolare gentilmente 200#956;l di siRNA per concentrazione (3 pozzetti per condizione + 1), con 200#956;l di Lipofectamina (senza mescolare troppo) e lasciare i campioni a RT al buio per 20’.
Aliquotare 100#956;l della soluzione ad una data concentrazione per pozzetto, con un volume finale di 600#956;l per pozzetto.
Incubare per 7h.
Trascorso il tempo di incubazione, rimuovere i 600#956;l di soluzione presenti in ogni pozzetto ed aggiungere terreno KM+ fresco. Incubare over-night.
Il giorno dopo, rimuovere il terreno da ogni pozzetto, aliquotare KM+ fresco e prendere una foto di ogni condizione al microscopio a fluorescenza, così da individuare la condizione di trasfezione migliore.
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Trasfezione con si
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