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Discussione

Klo
Nuovo Arrivato

Prov.: Roma

107 Messaggi

Inserito il - 10 aprile 2008 : 18:29:31

Ciao a tutti, magari � una domanda stupida.
Nel metodo di Sanger io clono il frammento che voglio sequenziare in un fago M13.Dopodich�,dice il libro, suddivido la miscela di reazione in 4 aliquote ognuna contenente 3 dNTP + 1 ddNTP diverso per ogni aliquota. A questo punto porto avanti la reazione di sintesi ed ottengo frammenti di lunghezza diversa che faccio correre su gel.La domanda � questa :una volta clonato il frammento nel fago come faccio a distinguerlo dal genoma del fago stesso? Cio� come faccio a separare l'inserto dal genoma in cui l'ho clonato?

Grazie mille

Marco De Giorgi
Nuovo Arrivato

Prov.: Lecce
Citt�: Monteroni di Lecce

55 Messaggi

Inserito il - 10 aprile 2008 : 18:46:36

Non c'� bisogno di separarlo perch� i frammenti che vedi alla fine sono i filamenti complementari al DNA clonato.Li vedi tramite autoradiografia perch� tra i 4 dNTP precursori utilizzati nella sintesi dalla DNA polimerasi almeno uno � marcato o si marca il primer.La sequenza che ricavi dal gel � la sequenza del filamento complementare al DNA che hai clonato.Non so se sono stato chiaro...

Klo
Nuovo Arrivato

Prov.: Roma

107 Messaggi

Inserito il - 10 aprile 2008 : 18:57:01

Scusa se tardo a capire..ho un p� di confusione, per� quando io clono l'inserto,di cui voglio sapere la sequenza, nel DNA fagico alla fine della clonazione avr� DNA misto di inserto e DNA di M13.Giusto? Allora quando poi vado a fare la reazione con i dideossi ottengo frammenti che sono di entrambi i DNA. E quindi li sequenzio entrambi...C'� qualcosa che non v�...perch� poi come faccio a sapere dove finisce la sequenza dell'inserto che a me interessava?

Marco De Giorgi
Nuovo Arrivato

Prov.: Lecce
Citt�: Monteroni di Lecce

55 Messaggi

Inserito il - 10 aprile 2008 : 19:13:42

La grandezza dell'inserto la devi sapere prima di effettuare il clonaggio perch� devi inserire nel vettore un inserto di dimensioni pari alla regione del fago che elimini.Se non mi sbaglio l'inserto non deve superare le 500 bp.Comunque si sequenziano tra i 250 e i 350 nucleotidi per volta.