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biocandy
Utente Junior
370 Messaggi |
 Inserito il - 06 marzo 2014 : 14:51:50
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Ciao a tutti! Sto usando Gel Qiaex II Extraction Kit per purificare prodotti di PCR (300 pb) dal gel di agarosio. L'eluizione finale è in 20 ul di H2O. Io uso 5 ul dell'eluato in una reazione di sequenziamento (BigDye Terminator) e poi purifico il mio prodotto utilizzando una piastra con membrana. La sequenza che ottengo è purtroppo di pessima qualità, con alcuni spike e un sacco di rumore di fondo. Pensate che dovrei cambiare metodo di purificazione? Qualcuno ha esperienza con questo kit Qiaex II? Grazie!!
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biocandy
Utente Junior
370 Messaggi |
Inserito il - 07 marzo 2014 : 10:22:40
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Nessuno?  |
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domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
Inserito il - 09 marzo 2014 : 13:28:22
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Non uso niente di tutto quello che usi tu, ma...
Citazione:
Io uso 5 ul dell'eluato in una reazione di sequenziamento
5 ul è un volume, una reazione di sequenziamento è una PCR quindi ha bisogno di una determinata quantità di DNA (in ug o meglio ancora in umol/uM). Cerca di capire la tua reazione che quantità di DNA ha bisogno e quanto DNA stai mettendo... |
Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato... |
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biocandy
Utente Junior
370 Messaggi |
Inserito il - 10 marzo 2014 : 17:45:34
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| Si, scusate ho dimenticato di scrivere 5 ul concentrati 17.1 ng/ul |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 10 marzo 2014 : 18:24:58
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Ma dopo la purificazione hai verificato l'integrità dell'amplificato?
Hai controllato cosa dice nella sezione "troubleshooting"?
Hai provato a contattare il servizio tecnico Qiagen? Sono lì apposta! |
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valestellina84
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 22 marzo 2014 : 11:18:24
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Di solito nello step finale di wash prima dell'eluizione si utilizza un buffer a base ti etanolo. Ora, spesso, se non si fa attenzione e non si elimina tutto l'etanolo, il DNA ne rimane contaminato e questo ostacola il sequenziamento.
Hai provato a fare uno spettro del tuo DNA per controllare? Di solito si vede una contaminazione se si ha picco a 230 nm.
In ogni caso, se ne hai la possibilità, io ti consiglierei di utilizzare i kit Promega. Per quanto Qiagen faccia ottimi prodotti, in tutto il mio dipartimento siamo d'accordo che per gel extraction e pcr purification sia meglio Promega. Io utilizzo WizardSV Gel Extraction Kit. |
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Miki_
Nuovo Arrivato
29 Messaggi |
Inserito il - 25 marzo 2014 : 13:00:40
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anche secondo me il kit della promega è meglio. hai controllato in ce range di basi funziona il kit qiagen?perchè magari purifica male i prodotti piccoli
secondo me stai usando un po' poco materiale, non riesci a caricare un po' più roba su gel?
occhio anche a quanto tempo tieni il gel sotto gli uv e a quanto agarosio recuperi perchè potrestri tirarti dietro schifezze...fai un gel un po' lasso (0,8-1%) e bassino.
ps. per mia esperienza se aspetti il servizio clienti qiagen puoi anche morire di vecchiaia prima di avere risposte sensate.. |
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Mauriello
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
Inserito il - 27 marzo 2014 : 14:01:30
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| Per sequenziare coi big dyes devi mettere 10 ng di DNA per ogni 100 bp di lunghezza del tuo frammento. Ne stai mettendo quasi il triplo |
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Didattica
