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Korha
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
 Inserito il - 29 settembre 2010 : 18:52:20
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Salve a tutti,
sono nuova del forum ma vi leggo da tempo...quindi ho pensato che potreste darmi un mano...
Brevemente, il mio problema è questo: devo down-regolare una particolare isoforma -poco studiata- di un gene (questo implica, purtroppo, che n'è commercialmente, n'è in pubblicazioni,ci sono sistemi già verificati  ).
Ho già disegnato un siRNA che come tale funziona alla perfezione, ma una volta inserito in un vettore - sotto "forma" di shRNA- non vedo nessuna dsown-regolazione.
Aggiungo che il vettore in questione è il pLKO-Tet-On,da Addgene e che ho seguito alla lettera il datasheet.
Il clonaggio è venuto al primo colpo e l'infezione anche...ma poi la linea non fa quello che deve...e il mio capo non ha gradito 
A qualcuno è mai successa una cosa del genere?!?!?!
Grazie per l'attenzione! 
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 30 settembre 2010 : 09:51:46
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a me, uguale uguale :( e non ho mai risolto il problema
efficienza di trasduzione/transfezione? |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 30 settembre 2010 : 09:57:25
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| (e c'è ancora in giro la testimonianza scritta) |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
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Korha
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 30 settembre 2010 : 09:57:45
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Caspita...non è incoraggiante!  Poi hai abbandonato il tuo esperimento o hai rimediato altrimenti?!
Per quanto riguarda l'efficienza di infezione posso solo dire che quando ho messo la puromicina di cellule non ne sono quasi morte, quindi immagino che fosse molto buona...ma non essendo un vettore GFP non ne ho la certezza.
Posso solo dire che ho mezzo a punto la tecnica di trasfezione/infezione con un vettore GFP e mi è sempre venuta ottima..ma ovviamente ogni volta è una cosa a se. |
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Moloney
Nuovo Arrivato
111 Messaggi |
Inserito il - 30 settembre 2010 : 11:11:33
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| Premetto che io non lavoro con shRNA (solo siRNA), quindi non sono sicuro di quello che sto per dire: ma lo short hairpin non ha delle sequenze a monte della sequenza interferente, che permette il processamento e l' intervento del RISC? Tu sei sicura che quelle sequenze che hai clonato (oltre al siRNA che comunque ha funzionato in transiente, quindi andrà bene) siano giuste? |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 30 settembre 2010 : 11:28:51
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Citazione:
Tu sei sicura che quelle sequenze che hai clonato (oltre al siRNA che comunque ha funzionato in transiente, quindi andrà bene) siano giuste?
Mi accodo : facendo troubleshooting mi è venuta in mente la stessa domanda. |
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Korha
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 30 settembre 2010 : 11:36:07
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Ehm...dunque, di base non me ne intendo molto di iRNA ma studiando per questo progetto avevo visto che si parlava più che altro di aggiungere delle T in coda... o più spesso si sottolinea come la sequenza del loop sia importante.
Io comunque ho seguito alla lettere le istruzione del datasheet in cui lo schema per la costruzione del shRNA è così definito:
-sito 1° enzima- SEQ SENSO -loop (che è il sito di taglio per XhoI)- SEQ ANTISENSO -sito 2° enzima-
Non si parla di aggiungere nessuna particolare sequenza...pensate che il problema possa essere questo?!
Avete qualche elemento che mi consigliate di provare ad aggiungere?
Grazie mille! |
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