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adham
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10 Messaggi |
 Inserito il - 18 settembre 2011 : 15:41:31
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salve a tutti,
dovrei amplificare una regione genomica di mio interesse con dei primer recanti delle sequenze con dei siti di restrizione, ho un dubbio molto stupido: nel primer forward è sufficiente che inserisca la sequenza di taglio per l enzima, ma nel reverse? come devo disegnarla? complementare alla sequenza di taglio? oppure la sequenza di taglio deve essere presente nel reverse? spero di essermi spiegato
F: 5'---sequenza di taglio-atgttagggtattggcgt,3'
mentre per il reverse quale vale?
R: 5'---complementare alla sequenza di taglio-tgtcggctaatcgattc
OPPURE
R: 5'---sequenza di taglio-tgtcggctaatcgattc
ho paura che se scegliessi la prima poi non riuscirei a creare una estremità complementare con il mio plasmide digerito col medesimo ER.
ditemi, grazie.
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 18 settembre 2011 : 16:00:22
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le sequenze riconosciute dai siti di restrizione sono palindrome, quindi come le giri le giri, son sempre uguali.
Es: EcoRI GAATTC. Il reverse complementare (mantenendo sempre la scrittura in orientamento 5'->3') è sempre GAATTC |
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adham
Nuovo Arrivato
10 Messaggi |
Inserito il - 18 settembre 2011 : 16:58:56
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Questo è vero ma bisogna fare attenzione all' orientamento di come disegnare la sequenza altrimenti si rischia di creare due estremità sfalzate (quella dell amplicone e quella del plasmide) non complementari, ad esempio se genero 2 sequenze con una 3' protruding queste non si appaieranno mai, o dico una cavolata?
scusatemi è la prima volta che mi trovo a doverlo fare e sono sommerso di dubbi.
plasmide:
3'-------------------5'
5'---------------3'
amplicone:
3'-------------------5'
5'---------------3'
non sono complementari no? |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 18 settembre 2011 : 17:08:30
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Non ho capito questo tuo ultimo messaggio, devo dire la verità. Cerchiamo di arrivare alla soluzione del tuo problema con un esempio. Ad esempio devi clonare un inserto, amplificato per pcr, all'interno di un plasmide digerito 5' con EcoRI e 3' con BamHI. Il tuo inserto va clonato di modo che al 5' abbia il sito ecoRI, al 3' BamHI.
La sequenza riconosciuta da EcoRI è GAATTC, quindi il primer F avrà: GAATTC-sequenza primer Forward.
La sequenza riconosciuta da BamHI è GGATTC, quindi il primer R sarà: GGATTC- sequenza primer Reverse.
Generalmente è consigliato aggiungere dei nucleotidi prima della sequenza di restrizione, perchè aumenta l'efficienza di taglio da parte dell'enzima (Es primer Forward ccgGAATTC -- sequenza primer F).
E' piu' chiaro così? |
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adham
Nuovo Arrivato
10 Messaggi |
Inserito il - 18 settembre 2011 : 18:59:56
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| ora mi è tutto chiaro, grazie. |
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