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colo
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1 Messaggi

Inserito il - 17 settembre 2009 : 14:34:24

Salve a tutti!
Devo fare una linea cellulare trasfettata stabilmente. Ho letto alcune discussioni nel vostro forum, e sono state molto utili per capire, ma per caso avete qualche protocollo da consigliarmi, oppure qualche articolo in cui viene descritto il metodo?
Grazie mille

Neuroscience
Utente

659 Messaggi

Inserito il - 17 settembre 2009 : 14:39:47

Non è per niente difficile, ma è scocciante da fare.

1) devi avere il tuo cDNA in un vettore che vada bene per le trasfezioni stabili, es che abbia il marker della resistenza ad un antibiotico come la neomicina, puromicina etc
2) devi conoscere/determinare la concentrazione minima dell'antibiotico che fa morire tutte le tue cellule non trasfettate
3) trasfetti il tuo vettore in cellule non a piena confluenza, dopo 1 giorno cambi il mezzo con l'antibiotico, e glielo cambi ogni tanto con del mezzo fresco+ antibiotico
4) aspetti il tempo necessario a far morire tutte le cellule non trasfettate e far crescre dei cloni
5) prendi i singoli cloni cellulari (dopo 1 mese circa) e li metti in piastre separate
6) verifica per WB, o per saggi funzionali il clone cellulare che meglio esprime la tua proteina.

In bocca al lupo