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Discussione

BioMol11
Nuovo Arrivato

18 Messaggi

Inserito il - 23 settembre 2011 : 10:55:08

Salve ragazzi sto studiando i vettori di espressione ma non mi � chiara una cosa. Il mio libro dice che i vettori di espressione vengono generati per creare sonde di Rna dal gene clonato ma anche per produrre una grande quantit� della proteina codificata. Per entrambi i casi si necessita la trascrizione dell'inserto di dna clonato nel vettore. Per avviare la trascrizione � necessario che il vettore di clonaggio presenti un promotore ed un sito di terminazione posto a valle del sito di clonaggio. quindi si procede in questo modo ( molto schematicamente):
1)purificazione del plasmide e linearizzazione
2)incubazione del plasmide con l'RNA polimerasi fagica + 4NTP
3)produzione di sonde ad RNA
il mio dubbio sorge al secondo punto in quanto sul mio libro c'� scritto che si utilizzano 3NTS( A G C) non marcati mentre U marcato. Perch� utilizziamo un nucleotide marcato?
Spero di ricevere presto una risposta. Grazie

SpemannOrganizer
Utente

Citt�: Los Angeles

955 Messaggi

Inserito il - 23 settembre 2011 : 12:02:34

il nucleotide � marcato generalmente con digossigenina o con biotina, ma trovi UTP marcati anche con fluoresceina. Il motivo � che ti serve un qualcosa per poter rivelare la presenza della sonda. Mi spiego, la sonda viene trascritta da un promotore orientato in maniera contraria alla ORF del cDNA da trascrivere (generalmente promotore T3 o T7). Quindi hai un filamento di RNA complementare all'mRNA trascritto normalmente da quel gene. questa sonda viene usata per rilevare la presenza dell'mRNA di tale gene (e quindi accertarsi dove e se sia trascritto) tramite ibridazione (per esempio in una in situ). Quando hai ibridato tale sonda per� ti serve qualcosa per visualizzare tale ibridazione: ecco quindi l'importanza della marcatura dei nucleotidi, perch� puoi utilizzare un anticorpo contro digossigenina e quindi un saggio colorimetrico per la rivelazione dell'ibridazione.

BioMol11
Nuovo Arrivato

18 Messaggi

Inserito il - 23 settembre 2011 : 12:31:47

Grazie mille ora � molto pi� chiaro:)

Del�
Nuovo Arrivato

6 Messaggi

Inserito il - 23 settembre 2011 : 15:58:05

sai se a milano nella specialistica in biologia molecolare posso frequentare anche tlb come specialistica?