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Zova
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
 Inserito il - 26 gennaio 2018 : 09:14:43
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Ciao a tutti!
Sono uno studente e c’è un concetto spiegato male sul libro dal quale sto studiando che non riesco a capire, potreste aiutarmi per favore?
Si parla di vettori di espressione, di plasmidi modificati e inseriti in batteri per la sintesi di proteine ricombinanti.
Dopo aver fatto pressione selettiva con l’antibiotico, sul libro c’è scritto che per individuare le proteine si possono usare anticorpi specifici che permettono di individuare e visualizzare la proteina.
Poi c’è scritto che se non è possibile questo, si inserisce una sequenza di DNA che codifica per marcatori proteici che sono individuabili dagli anticorpi in nostro possesso.
La mia domanda è: in entrambi i casi l’anticorpo si lega alla proteina di interesse o altre? Se si lega alla proteina di interesse questo significa che il tag viene inserito all’interno della sequenza codificante per la proteina?
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Geeko
Utente
Città: Milano
1043 Messaggi |
Inserito il - 26 gennaio 2018 : 20:52:58
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| Esatto, più che all'interno lo si posiziona solitamente ad una delle due estremità della sequenza codificante la tua proteina. Generalmente il tag è già presente nel vettore di espressione. |
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Zova
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
Inserito il - 27 gennaio 2018 : 10:08:08
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| Grazie mille Geeko, quindi quando una proteina non possiede una sequenza amminoacidica alla quale può legarsi un anticorpo la si inserisce e questo non influisce sulla sua funzionalità? |
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domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
Inserito il - 27 gennaio 2018 : 11:35:01
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| Di solito i tag hanno un folding tutto loro e non c'è interferenza con gli altri domini proteici. Comunque prima di iniziare gli esperimenti conviene testare le funzioni conosciute della proteina per confermare che il tag non interferisca. Ovviamente se all'N-term c'è una funzione specifica (di solito una sequenza di localizzazione cellulare ad esempio) e ci piazzi un tag prima, questa non funzionerà più. |
Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato... |
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Geeko
Utente
Città: Milano
1043 Messaggi |
Inserito il - 27 gennaio 2018 : 11:38:00
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Sulla prima parte della tua domanda, si. A volte per alcune applicazioni anche se si dispone di un aticorpo che riconosce in modo specifico la tua proteina si è costretti ad usare una versione "taggata" in modo da permetterti di distinguere ad esempio la proteina trasfettata (contenente magari una mutazione generata da te per studiarne la funzione) da quella endogena, proprio usando un anticorpo contro il tag.
Sul secondo punto: bhe questo è il downside maggiore dell'utilizzo di proteine taggate. Certo che il tag può influenzare la funzionalità della proteina, specialmente tanto più grande è il tag rispetto alla tua proteina (un GFP-tag è ben più voluminoso di un FLAG-tag per esempio). Ci sono casi in cui per come è ripiegata la proteina il tag può benissimo impedirne la funzione, anche se è difficile stabilirlo a priori. In ogni caso è buona norma includere nell'esperimento tutti i controlli del caso. Inoltre le problematiche dell'uso dei tags sono diverse a seconda dell'uso che ne intendi fare (es. per purificare la proteina o per studiarne la funzione, in vitro o in vivo). |
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Zova
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
Inserito il - 28 gennaio 2018 : 10:09:20
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| Davvero grazie mille, gentilissimi! |
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