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arper
Nuovo Arrivato
7 Messaggi |
 Inserito il - 15 ottobre 2008 : 19:03:11
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come si descrive una procedura di pcr per mutagenizzare
una sequenza?dove posso trovare in internet argomenti simili?
ciao e grazie
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morgan79
Utente Junior
Prov.: Bari
143 Messaggi |
Inserito il - 15 ottobre 2008 : 22:41:38
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Ho et al, Gene, 1989
"Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction." |
il sapere non è sufficiente, bisogna applicare; il volere non è sufficiente, bisogna fare |
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metionina
Nuovo Arrivato
Città: Cambridge
45 Messaggi |
Inserito il - 15 ottobre 2008 : 22:42:40
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ciao!
io ho usato una procedura per mutagenizzare in un sito specifico una sequenza su un plasmide grazie a una PCR. La tecnica è molto semplice: usavo dei primers contenenti la mutazione, amplificavo, e digerivo il plasmide non mutato in modo da avere solo quello mutato... Puoi trovare tutte le info e le spiegazioni dettagliate se vuoi nel manuale del kit: QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene)
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morgan79
Utente Junior
Prov.: Bari
143 Messaggi |
Inserito il - 15 ottobre 2008 : 22:49:10
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| senza comprare kit, la strategia di Ho è molto semplice, si disegno primers contenenti la mutazione (chiamiamoli mut for e mut rev) e primer che amplificano il gene(for e rev ad esempio). Il primo ciclo di PCR prevede due amplificazioni , For e mut rev, Rev e mut for. Si purificano le due PCR, si pullano e si amplificano con i primer For e Rev e se comprendono i siti di restrizione al 5' si digerisce ed è pronto per clonare. I meccanismi sono spiegati nel lavoro di Ho |
il sapere non è sufficiente, bisogna applicare; il volere non è sufficiente, bisogna fare |
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metionina
Nuovo Arrivato
Città: Cambridge
45 Messaggi |
Inserito il - 15 ottobre 2008 : 23:22:32
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| si tratta di 2 tecniche diverse, dipende da dove è il gene che vuoi mutare, ovvero se è già clonato in un plasmide oppure no |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
Inserito il - 15 ottobre 2008 : 23:48:33
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Quoto quanto detto da metionina,sono 2 cose diverse..cmq entrambi i casi vanno bene per la risposta che serve ad arper
inoltre il kit stratagene e' ottimo,perche' c'e' la DNAsi che digerisce il vettore di partenza,in questo modo non hai contaminazione negli esperimenti che si faranno dopo averlo mutato
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morgan79
Utente Junior
Prov.: Bari
143 Messaggi |
Inserito il - 17 ottobre 2008 : 07:56:20
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| A questo punto si potrebbe amplificare l'intero vettore con i primer mutagegnizzanti impostando 16 cicli di PCR con una taq tipo pfu o pfx, che non aggiunge A alla fine. Se il prodotto di PCR si digerisce con DpnI, un enzima di restrizione a 4 basi che digerisce solo siti con basi metilate, digerirà solo il filamento batterico,quindi il DNA di partenza, lasciando integro il vettore di neosintesi che non avrà metilazioni. Tale prodotto si usa per trasformare cellule competenti. |
il sapere non è sufficiente, bisogna applicare; il volere non è sufficiente, bisogna fare |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
Inserito il - 17 ottobre 2008 : 08:57:58
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Citazione:
Messaggio inserito da morgan79
Tale prodotto si usa per trasformare cellule competenti.
Ehm..si il resto va bene ,solo che tale prodotto si usa per trasfettare cellule eucariotiche 
Le cellule competenti ti servono per metilare appunto il vettore wt di partenza e replicarlo,tra l altro devono essere delle lina DH5-alfa |
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morgan79
Utente Junior
Prov.: Bari
143 Messaggi |
Inserito il - 17 ottobre 2008 : 14:04:51
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| ma la trasfezione passa comunque per i batteri, vanno verificate le colonie positive con PCR di sequenza e va eseguita una midi-maxi prep |
il sapere non è sufficiente, bisogna applicare; il volere non è sufficiente, bisogna fare |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
Inserito il - 17 ottobre 2008 : 15:41:13
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| ok,diciamo quindi che passano prima della mutagenesi in E Coli affinche' si replicano e vengano metilati i siti,a questo punto vengono mutagenizzati e ulteriormente traformati per ottenere una gran quantita' di plasmide mutato e successivamente trasfettati |
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MaryngA
Nuovo Arrivato
Prov.: Parma
Città: Parma
29 Messaggi |
Inserito il - 17 ottobre 2008 : 17:38:46
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| Beh dato che si sta parlando in linea generale si possono voler mutare anche geni batterici e quindi la frase 'subito pronte per la trasformazione' sarebbe corretta; oppure potremmo voler ottenere proteine mutate eucariote esprimendole in coli per studi funzione/struttura quindi come sopra! |
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Discussione |
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mutagenesi con PCR[era:pcr]
Didattica
