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Cikobiotech
Nuovo Arrivato

37 Messaggi

Inserito il - 29 dicembre 2008 : 18:11:46

Il mio quesito � il seguente: A partire da DNA genomico genero frammenti di DNA con estremit� piatte tramite trattamento blando con enzimi di restrizione (HaeIII e Alul).
Sappiamo ora che per l'introduzione di questi frammenti all'interno di un vettore l 'estremit� piatte non sono l'optimum.
Quindi gliele forniamo. Trattiamo il DNA con DNAmetilasi di EcoRI e S-adenosilmetionina , cos� da metilare i frammenti di DNA. Poi trattiamo tale DNA con eccesso di linker oligonucleotidici con estremit� piatte (che hanno sito di riconoscimento per EcoRI)e in presenza di alte concentrazioni di DNA ligasi.
Ora mi chiedo se � possibile che in presenza di alte concentrazione di DNA ligasi si possano ligare i frammenti stessi di DNA (in modo casuale), e se ci� � deletereo ai fini del clonaggio?

Schuldiner86
Utente Junior

Prov.: Viterbo
Citt�: Bologna

581 Messaggi

Inserito il - 29 dicembre 2008 : 20:40:40

Vado per ipotesi...La reazione potrebbe essere portata avanti anche in presenza di un largo eccesso stechiometrico di linker rispetto ai frammenti di genomico...Devi anche pensare che se si uniscono due frammenti di genomico tra di loro, la metilazione impedisce il taglio dei frammenti uniti da parte di EcoRI e quindi non ci sarebbe neanche modo di farli entrare nei vettori...Contorto, ma spero di essermi spiegato...

Cikobiotech
Nuovo Arrivato

37 Messaggi

Inserito il - 29 dicembre 2008 : 22:34:01

Claro che si

...non ci avevo pensato al fatto che unendo 2 frammenti di genomico questi "avessero"(non � certo al 100% che ci sia , o sbaglio?) il sito di restrizione impedito dalla metilazione.
Sempre tu a darmi risposte...se non ci fossi tu???!!!!

Schuldiner86
Utente Junior

Prov.: Viterbo
Citt�: Bologna

581 Messaggi

Inserito il - 29 dicembre 2008 : 22:43:48

Si fa quello che si pu�...Sempre lieto!!!