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salentina
Nuovo Arrivato
Prov.: Lecce
1 Messaggi |
 Inserito il - 11 febbraio 2006 : 14:43:21
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salve a tutti!
non pensavo ci fosse un forum dove poter chiedere aiuto... figo!!
raga,ho bisogno di saxere le differenze tra i 2 metodi,e soprattutto...come si traccia la retta di taratura??
confido in voi x il mio esame imminente!! 
grazie
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salento regione autonoma |
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Luis 22
Utente
Città: Bari
755 Messaggi |
 Inserito il - 11 febbraio 2006 : 16:20:15
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Ma biorad non è la famosissima "marca" biotecnologica?
Non credo sia una metodica! |
 
La vita e i sogni sono fogli di uno stesso libro. Leggerli in ordine è vivere, sfogliarli a caso è sognare. (Arthur Schopenhauer)& |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 11 febbraio 2006 : 22:37:35
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Biorad e' semplicemente una marca di prodotti, tuttavia che io sappia fanno solo il Comassie Blue per la quantificazione delle proteine... quindi la domanda e': che differenza c'e' fra il metodo di Bradford e il metodo del biureto?
Ad ogni modo i due metodi sono metodi colorimetrici, cioe' si basano sull'aggiunta di un composto che cambia colore in presenza di proteine e che poi viene quantificato con lo spettrofotometro.
Il metodo di Bradford si basa sull'utilizzo del Coomassie blue:
Questo composto ha un picco di assorbanza a 465nm ma, in ambiente acido, questo picco si sposta a 595nm quando il Coomassie si lega alle proteine (all'Arg e agli amminoacidi idrofobici, in particolare, come puoi immaginare dalla struttura chimica).
Quindi, se fai una soluzione con Coomassie blue, etanolo e acido fosforico e la aggiungi ad un campione contenente proteine, puoi misurare l'assorbanza a 595nm: piu il campione assorbe piu proteine ci sono. Per avere una quantificazione piu precisa serve pero una curva standard, vedi sotto.
Questo e' il metodo piu usato per quantificare le proteine, e' molto sensibile (2-20 ug/ml di proteine) e veloce.
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Il metodo del biureto (che non credo nessuno usi piu ora mai...), invece, si basa sull'uso di sali di rame.
Aggiungendo Cu++ alla tua soluzione (es. come CuSO4) in ambiente alcalino questo si lega ad alcuni residui delle proteine, non ricordo quali. Il biureto si lega a questi complessi e forma un composto colorato che assorbe a 540nm.
Questo e' il biureto:
Questo metodo e' poco sensibile (vedi mg di proteina, contro i ug del Bradford), usa sali di rame che sono tossici e richiede 10-20 minuti di incubazione prima di sviluppare il colore.
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La retta di taratura di solito si fa con degli standard di una proteina nota, solitamente albumina.
Quindi prendi 5 o 6 campioni di BSA a concentrazione nota, nei limiti di concentrazione del tuo metodo ovviamente. Ad esempio per il Bradford potresti prendere 1, 2, 5, 10, 15 e 20 ug/ml. Insieme ai tuoi campioni misuri anche questi standard, valutandone l'assorbanza. Secondo la legge di Lambert-Beer l'assorbanza sara' direttamente proporzionale alla concentrazione, quindi le assorbanze degli standard staranno su di una retta, piu o meno precisa a seconda della bravura dell'operatore! 
Quindi, trovi le assorbanze, fai una regressione lineare per trovare una retta e poi usi quella come una normalissima retta di taratura: una volta che sai l'assorbanza del tuo campione vai a vedere che concentrazione dello std ti dava quell'assorbanza.
PS: nota che a volte le concentrazioni troppo alte o troppo basse deviano dalla linearita'. Se la concentrazione e' troppo alta in generale si puo diluire il campione e poi moltiplicare la concentrazione ottenuta per il fattore di diluizione. |
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Miss Adenina
Nuovo Arrivato
Prov.: Napoli
45 Messaggi |
Inserito il - 01 marzo 2006 : 13:50:49
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E riguardo alla modifica di Lowry sulla (ormai preistorica) reaz del Biureto???
Modifica di O.H.Lowry (che è molto utile per la sua magg sensibilità) --> si aggiunge alla classica reaz del biureto un 2° reattivo... QUALE? (...che produce composti colorati poichè il 2° reattivo reagisce con gli aa aromatici).
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Luis 22
Utente
Città: Bari
755 Messaggi |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 01 marzo 2006 : 21:59:17
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Un metodo molto simile a quello di biureto dovrebbe essere
il BCA-assay, dove BCA sta per bicichinonic acid (spero di averlo scritto giusto).
Sempre di un composto che coordina il rame si tratta.
La Biorad produce anche apparecchi elettroforetici di infima qualità,
vi auguro di non avere mai a che fare con quegli aggeggi impossibili.
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 02 marzo 2006 : 00:33:16
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Bah! sarà che tutti i supporti per PAGE della Biorad
che mi fornirono per i laboratori didattici
facevano decisamente defecare...
Forse erano dei modelli economici, non lo so,
so solo che per montare un solo gel
ci voleva quasi un'ora (solo per il montaggio!)
anche sotto la mano del professore. |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 02 marzo 2006 : 01:16:49
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Ah... ho capito. Probabilmente per i laboratori ti hanno rifilato gli antichi supporti x PAGE che sono in effetti molto noiosi da montare (anche se dopo che li hai usati per un po' di volte diventa tutto più facile).
I nuovi supporti sono facilissimi da usare e si assemblano in un minuto più o meno.
Inoltre devo lodare il servizio clienti di Biorad sempre puntuale e veloce a rispondere (ora però basta fare pubblicità occulta! :D)
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b-52
Nuovo Arrivato
Prov.: Lecce
17 Messaggi |
Inserito il - 18 marzo 2009 : 15:26:40
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sei un pazzo fottuto,la formula che tu pensi sia il biureto, non credo proprio sia il biureto. Ma chi te lo ha detto?
Il reattivo del biureto è composto da: NaOH(per rendere l'ambiente basico), tartrato di sodio potassio (per impedire la precipiitazione di idrossido di rame), CuSO4(che essendo unsale si dissocia in Cu++ e SO4--), il rame instaura legami di cordinazione con gli azoti dei legami peptidici. Consentendo quindi la rilevazione della quantita di proteina, leggendo l'assorbanza(con lo spetro fotometro)a 540nm.
ai capito chick80.
Ciao!!!!!!  |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 18 marzo 2009 : 15:48:21
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Prima di tutto ti invito a moderare i toni, non mi sembra proprio una cosa troppo simpatica da scrivere (e questo è un richiamo ufficiale).
Seconda cosa, è vero, tu hai ragione sul reattivo del biureto, ma ho ragione io sulla formula del biureto.
Il biureto è un prodotto di condensazione dell'urea, che reagisce con il rame nello stesso modo delle proteine, è per questo che il metodo del biureto si chiama così, anche se effettivamente il reattivo non contiene biureto.
Vedi http://en.wikipedia.org/wiki/Biuret |
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b-52
Nuovo Arrivato
Prov.: Lecce
17 Messaggi |
Inserito il - 18 marzo 2009 : 16:15:44
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Ripeto, non volevo offendere in alcun modo. Ma forse non avevo solo ragione riguardo al reattivo usato per il dosaggio proteico, ma (2 CO(NH2)2 #8594; H2N-CO-NH-CO-NH2 + NH3 #8593;) anche nel link da te suggeritomi, come appunto cercavo di dirti prima,la formula è diversa da quella da te scritta nel forum. E comunque potevi anche dirlo prima, che quella formula da te scritta non centrava assolutamente niente, o comunque poco, con la tecnica del biureto.
saluti |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 18 marzo 2009 : 16:33:46
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Riguardandolo bene in effetti manca un azoto in mezzo.
La formula giusta è: 
Ma scusa, curiosità... perchè tutto questo interesse per il biureto? E' un metodo obsoleto e poco sensibile... |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 18 marzo 2009 : 16:36:38
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| PS: per quanto riguarda il fatto che siano cose diverse l'ho scoperto ora rileggendo quella pagina. Ho sempre immaginato che il reattivo del biureto contenesse biureto, invece no! |
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b-52
Nuovo Arrivato
Prov.: Lecce
17 Messaggi |
Inserito il - 18 marzo 2009 : 16:40:14
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lo so. questo accanimento è dovuto al fatto che, dopo la "completa" preparazione per l'esame di biochimica, non ho potuto sostenere l'esame per colpa del biureto. (io odio il biureto)
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Discussione |
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biureto e biorad
Didattica
