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Viper
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
 Inserito il - 17 gennaio 2009 : 10:24:25
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Salve a tutti!! Sono nuovo e volevo complimentarmi per questo forum è veramente molto interessante!
Sto preparando una tesina sull'insulina ricombinante ma nn riesco a capire i passaggi precisi che mi descrivano l'operazione (taglio del dna, inserimento in un vettore di espressione, purifica e quanto segue) ho le idee molto confuse soprattutto sul perchè si debba usare il gene lacZ e aggiungerci la metionina...
qualcuno potrebbe illuminarmi?
grazie a chiunque risponda :D
ciao ciao
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legolas
Utente
Prov.: Lecce
Città: Trepuzzi
723 Messaggi |
Inserito il - 17 gennaio 2009 : 10:37:40
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| Hai provato se c'è qualcosa sul testo BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI di Glick e Pasternak? |
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Viper
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 17 gennaio 2009 : 10:48:48
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| Si ho cercato anche li ma niente...mi dice in generale che le due catene vengono fatte esprimere separatamente ma niente di più specifico... |
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Schuldiner86
Utente Junior
Prov.: Viterbo
Città: Bologna
581 Messaggi |
Inserito il - 17 gennaio 2009 : 12:39:24
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| Se mi parli di lacZ e metionina mi vengono in mente due modi per selezionare i traformanti, su un terreno privo di metionina e col sistema dell'alfa-complementazione della beta-galattosidasi...Nono so purtroppo dove trovare qualcosa di specifico, ma se chiedi dove ti blocchi e spieghi il contesto dell'esperimento ci possiamo provare a darti una mano passo passo... |
 
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Viper
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 17 gennaio 2009 : 13:16:41
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Va bene allora ti quello che ho capito io e ti spiego in quali punti ho delle difficoltà...
In coli faccio esprimere separatamente le due catene dell'insulina (A e B) in due trasformanti diversi
quindi prendo i geni che codificano per le due catene li taglio e li inserisco in due vettori di espressione con i quali trasformerò i batteri
Adesso nella costruzione del vettore se nn ho capito in sequenza male ho:
promotore-lacZ(per la B-gal)-Metionina-Catena A o B e resistenza ad un antibiotico
quindi faccio esprimere le due catene nn so come, le purifico non so come, e poi le unisco facendo si che si creino i legami disolfuro nn so come.altra domanda enorme: nel costrutto cosi complessato io avrò solo B-Gal funzionale che nn mi serve per fare uno screening bianco blu quindi probabilmente il gene lacZ cosi inserito avrà altre funzioni???
poi i frammenti che prendo contenenti le due catene come li ottengo? per restrizione?pcr? boh
poi perchè far esprimere le due catene separatamente??
come vedi ho un po di dubbi :D
anche se me ne risolvessi qualcuno mi saresti di graaande aiuto
grazie mille !! |
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P4P3R11
Nuovo Arrivato
7 Messaggi |
Inserito il - 17 gennaio 2009 : 13:21:00
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| Sul Brock 1 c'è tutto quello che vuoi sapere. Se non riesci ad averlo, cercherò di aiutarti io. |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 17 gennaio 2009 : 14:05:52
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uhmmm...
se dovessi fare io questa cosa dovrei affrontare diversi problemi, A sono i problemi, B le possibili soluzioni proposte da me
A) l'insulina è un gene singolo, ma durante la maturazione è tagliato in due da un enzima che non è presente nei batteri
R) si possono generare i due frammenti proteici dell'insulina singolarmente, quindi usando 2 cDNA per le rispettive zone
A) l'inizio della traduzione proteica è fatta da una metionina ed una sequenza che nei batteri è chiamata Shine-Dalgarno. Se tagli il cDNA in due, almeno uno dei due geni non avrà la metionina all'inizio, tanto meno avranno la sequenza che innesca la traduzione proteica
R) allora ognuno dei vettori contenenti i cDNA devono avere una metionina creata da noi per iniziare la sintesi, completa di sequenza consenso Shine-Dalgarno per promuovere la traduzione proteica.
A) l'insulina è prodotto come pre-pro-ormone, quindi significa che oltre al taglio già mensionato nel punto 1, avrà anche un taglio all'inizio della proteina per rimuovere il segnale di esocitosi eucariotica
R) possiamo fare questa modifica direttamente sul cDNA e rimuovere la sequenza aminoacidica che non si trova nell'insulina matura
A) L'insulina ha diversi ponti disolfuro che uniscono la catena alfa alla catena beta, i batteri non possono generare i ponti disolfuro al proprio interno poiché l'ambiente citosolico è riducente
R) I ponti disolfuro si possono generare direttamente in soluzione, in particolari condizioni già ritrovate da alcuni ricercatori, dove basta mischiare i due frammenti proteici ad una concentrazione ideale in cui ci sono anche degli agenti ossidanti che aiutino la formazione dei ponti di solfuro. La struttura tridimensionale dei due frammenti dell'insulina favoriranno la formazione dei ponti giusti, attraverso una purificazione cromatografica si elimineranno le tracce delle proteine con i ponti disolfuro errati
A) L'insulina verrà prodotta all'interno dei batteri dove ci sono anche sostanze altamente letali se somministrate insieme all'insulina, i liposaccaridi per esempio.
R1) Si può fare una purificazione mediante affinità. Con un anticorpo che riconosce solo l'insulina è possibile fare una colonna cromatografica in cui versare la soluzione lisata dei batteri. L'anticorpo nelle condizioni X legherà solo l'insulina mentre tutto il resto passa attraverso la colonna. Versando la soluzione acquosa Y con diverso pH l'anticorpo per l'insulina la rilascia e si può raccogliere solo l'insulina.
R2) altri più furbi, modificicano direttamente l'insulina nel suo cDNA mettendoci qualche amminoacido in più che è riconosciuto da un anticorpo migliore rispetto a quello dell'insulina, facilitando la purificazione, ad esempio lacZ, Flag, Tag, braccio di istidina.
A) come ottenere i cDNA dell'insulina?
R) Facilissimo, prendi un pancreas, o meglio le cellule beta secernenti insulina che si trovano direttamente in coltura, omogenizzi e recuperi l'RNA, poi retrotrascrivi in cDNA ed amplifichi per PCR solamente il cDNA dell'insulina. Metti questo prodotto in un vettore di espressione, esegui le modifiche suddette come il taglio in due zone, modifiche varie etc etc.
A) perché fare esprimere le due catene separatamente?
R) perché le due catene hanno un'ottima affinità reciproca, dato che li generi all'interno di piccoli batteri in condizioni non ideali per loro precipitano quando raggiungono una concentrazione critica. Se li produci separatamente hai un po' meno precipitati e di conseguenza puoi avere più proteina solubile buona.
A) come faccio a convincere i batteri a produrre l'insulina? La presenza dell'insulina ad alte concentrazioni determinerà una qualità della vita batterica pessima, ovvio che i batteri che distruggono il vettore che fa esprimere loro l'insulina darebbe un grosso vantaggio, anche solo ridurre la quantità di vettore sarebbe l'ideale.
R) effetto carota bastone. Il vettore di espressione contiene anche il gene per la resistenza ad un antibiotico (ampicillina o kanamicina), ed i batteri crescono proprio in presenza di ampicillina o kanamicina. Se i batteri perdono o riducono la quantità di vettore al proprio interno diminuiscono anche la propria resistenza in presenza dell'antibiotico. I batteri con più vettore, e di conseguenza con più insulina, proliferano meglio grazie ad una maggiore quantità di gene che dà la resistenza all'antibiotico.
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Viper
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 20 gennaio 2009 : 16:24:57
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prma di tutto grazie per le risposte mi siete stati davvero molto utili.
nel prosequio della mia tesina mi sono sorte altre domande però :D
nella produzione di nuove insuline sono stati sostituiti alcuni aminoacidi nella sequenza. adesso mi chiedo come hanno fatto a scoprire che proprio la sostituzione di quell'aminoacido potesse conferire nuove proprietà?
sono stati fatti esprerimenti di mutagenesi o cosa?
poi altra cosa..ho letto che la seq di DNA codificante per l'insulina viene sintetizzata chimicamente...come si sintetizza chimicamente una sequenza?
grazie per la vostra collaborazione e pre il vostro tempo!! |
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