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zerhos
Utente Junior
Prov.: Pisa
Città: Pisa
421 Messaggi |
 Inserito il - 07 febbraio 2009 : 16:28:13
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questa è una di quelle tecniche che ti permette di analizzare l'esatta sequenza dell'estremità 5' del filamento trascritto.
il motivo è presto detto,come fai in un genoma a DNA a sapere precisamente dove finisce la sequenza promotrice e dove inizia il +1 dell'mRNA?ecco questa metodica può darti la risposta.
praticamente prendi questo mRNA di cui vuoi vedere la sua estremità 5',e se ne conosci una parte di sequenza puoi costruirti un primer complementare e appaiarlo(la sequenza di appaiamento deve stare al 3' dello stampo così dirigi la sintesi verso il suo 5',spero ti sia chiaro 0_0)
3'<---5' primer*
5'-----------------3' questo è l'mRNA di cui vuoi sapere il 5'
*non so perchè ma sul disegno nn mi fanno partire il primer dall'estremità 3' dello stampo,cmq tu immaginalo così
quindi ottieni una struttura in cui l'mRNA fa da stampo e il primer serve da innesco per una trascrittasi inversa che produce cDNA,la intesi continua ovviamente finchè c è il filamento stampo,quando raggiunge l'estremità 5' la sintesi si interrompe e si generano dei filamenti la cui lunghezza va dal primer aggiunto all'estremità 5' del mRNA stampo e le dimensioni di questi filamenti te le vai a misusare con l'elettroforesi.
Per sapere oltre alla dimensione la sequenza esatta del 5',prendi questi filamenti appena sintetizzati di cDNA e utilizzi una poli-A transferasi che ti aggiunge alla loro estremità 3' una coda poli-A
poi sfrutti il fatto che la coda di poli-A è una sequenza nota e ci puoi attaccarci un secondo primer(che ad occhio sarà TTTTTT :D)quindi ci fai una bella PCR per amplificarlo e fai un sequenziamento di sanger e ottieni la sequenza esatta!
spero di essere stato utile. |
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Salvador.Dalì
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oligo capping e primer extension
Didattica
oligo cap e pr ext.doc
