| Autore |
Discussione |
|
|
aciredef
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
 Inserito il - 03 febbraio 2009 : 18:33:26
|
Ciao a tutti!
Ho un problema con il western blot e vorrei un consiglio da chi e' piu' esperto di me. Utilizzo un gel di poliacrilamide per separare ed individuare una proteina di 30KD, ma per qualche sconosciuto motivo da qualche settimana lo stacking gel non polimerizza piu'. Io uso questo protocollo per preparare il gel al 4%(5ml): H2O distillata 3,050ml,Tris 0,5M ph 6,8 1,250ml,SDS 10% 0,05ml,Acrilamide 30% 0,650ml,Ammonio persolfato 0,025ml,TEMED 0,006ml.
La cosa assurda e' che il separeting gel, preparato con lo stesso materiale,ma a concentrazioni diverse polimerizza. Se provo ad aumentare le concentrazioni dell'ammonio persolfato o del temed? Un'altra cosa strana, mai successa, e' che sotto il pettinino per i pozzetti si formano molte bolle e il gel, se lasciato un giorno, polimerizza parzialmente (normalmente impiega circa 30min a polimerizzare)e si riduce di volume. Ho ripreparato SDS e ammonio persolfato e utilizzato acrilamide nuova, ma non e' cambiato nulla!
Accetto qualunque tipo di suggerimento...grazie
|
|
|
|
|
chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 03 febbraio 2009 : 18:45:17
|
Hmmmm... l'ammonio persolfato va preparato fresco ogni volta (lo puoi riusare per 2 o 3 giorni, ma poi non è più buono). In generale se aumenti la [] di TEMED o di APS velocizzi la polimerizzazione.
Controlla il pH del Tris, magari rifai la soluzione. Non so se il TEMED possa "scadere", penso di no. |
Sei un nuovo arrivato?
Leggi il regolamento del forum e presentati qui
My photo portfolio (now on G+!) |
 |
|
|
mattia.dinunzio
Nuovo Arrivato
116 Messaggi |
Inserito il - 04 febbraio 2009 : 08:56:12
|
seprima polimerizzava e adesso no cambia tutti i reagenti. magari vai in prestito prima di comprarli
Ciao |
|
|
|
Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 04 febbraio 2009 : 11:09:13
|
Citazione:
Messaggio inserito da chick80
Non so se il TEMED possa "scadere", penso di no.
anche io penso di no però se è molto vecchio si formano dei depositi più densi sul fondo ed è bene agitarlo prima di usarlo.
però la cosa strana è che il separating ti polimerizza
per le bolle sul fondo del pozzetto, prova ad inserire il pettine in modo inclinato, partendo da un lato o magari cola il gel dopo aver inserito il pettine |
...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
|
|
|
|
là
Utente Junior
565 Messaggi |
Inserito il - 04 febbraio 2009 : 12:18:22
|
ti scrivo il mio protocollo per la preparazione dei tampone per fare i gel:
Lower buffer 4X:
tris-base 1,5 M finale
SDS 0.4% finale
porti a pH 8.8
Upper buffer 4X:
tris-base 0.5 M finale
SDS 0.4% finale
porti a pH 6.8
Io di solito preparo i gel al 10%, li faccio così:
2.5 ml lower buffer 4X
acrilammide 40% (37:1) 2.5 ml
porto a volume di 10 ml con acqua
APS 10% 60 ul
TEMED 30 ul
1.25 ml di upper buffer 4X
acrilammide 40% 563 ul
porto a volume di 5 ml con acqua
APS 10% 45 ul
TEMED 30 ul |
|
|
|
aciredef
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 04 febbraio 2009 : 22:08:13
|
| Grazie a tutti per i suggerimenti!!! Ho misurato il pH del tris ed era superiore a 8 invece di 6.8; ho rifatto la soluzione e ho risciolto anche L'APS, ma il gel non ha polimerizzato. Ho fatto poi un altro tentativo raddoppiando APS e temed e ha polimerizzato. L'APS e il temed possono essere dosati in base alla velocità di polimerizzazione o bisogna rispettare un certo rapporto tra APS e acrilamide per non compromettere la corsa della proteina? Non riesco a evitare che si formino le bolle nei pozzetti laterali, nonostante ho provato a colare il gel sul pettine, eppure per come e' fatta la cameretta l'aria non dovrebbe proprio entrare. Domani ci riprovo... |
|
|
|
chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 04 febbraio 2009 : 22:13:51
|
Citazione:
L'APS e il temed possono essere dosati in base alla velocità di polimerizzazione o bisogna rispettare un certo rapporto tra APS e acrilamide per non compromettere la corsa della proteina?
No, non ci dovrebbero essere problemi, l'APS semplicemente è un iniziatore radicalico che inizia la reazione di polimerizzazione dell'acrilamide se ne metti un po' in più velocizzi la reazione, tutto qui. |
Sei un nuovo arrivato?
Leggi il regolamento del forum e presentati qui
My photo portfolio (now on G+!) |
|
|
|
GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 04 febbraio 2009 : 22:50:13
|
Attenzione che è vero che l'APS va preparato fresco, ma in realtà non basta!
L'APS tende ad assorbire acqua dall'umidità dell'aria, quindi dopo un po' (se non lo tieni sotto la campana essiccatrice) "aumenta di volume" perchè contiene anche acqua, quindi quando lo pesi in realtà prendi un quantità inferiore di APS, la tua soluzione di APS quindi è meno concentrata e la reazione di polimerizzazione è più lenta o addirittura non avviene!
Io avevo risolto aumentando di una volta e mezza la quantità di APS che mettevo nel gel e polimerizzavano benissimo.
Citazione:
Messaggio inserito da aciredef
Ho misurato il pH del tris ed era superiore a 8 invece di 6.8;
Questo non c'entra con la polimerizzazione, ma comunque è bene che tu l'abbia rifatto, altrimenti non funzionerebbe il gel, non sarebbe più uno stacking!!!
 |
|
|
|
chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
|
|
GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 05 febbraio 2009 : 09:30:23
|
Citazione:
Messaggio inserito da chick80
... igroscopico...
igroscopico... cavolo ieri sera non mi veniva la parola!!!  A furia di parlare altre lingue! 
Comunque non molti lo sanno e di solito viene tenuto tranquillamente all'aria. |
|
|
|
chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
|
|
GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 05 febbraio 2009 : 12:55:52
|
Citazione:
Messaggio inserito da chick80
Scusa... dovevo dire hygroskooppinen
nooooooooooo "hygroskooppista" si declina!!! 
"APS on hygroskooppista" |
|
|
|
maravg
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
Inserito il - 05 febbraio 2009 : 16:51:20
|
Io so che anche la temperatura influisce, una volta mi è successa una cosa del genere edopo molte prove e informazioni chieste in giro...ho scoperto che lo stacking era giusto giusto in linea con il getto del condizionatore..cambiando posto...eliminato il problema.
Non ho letto tutte le risposte, magari fai una prova in due becker separati con i due gel e vedi se li si polimerizza.
Forse è un suggerimento stupido ma provar non nuoce |
|
|
|
aciredef
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 09 febbraio 2009 : 20:22:08
|
Citazione:
Comunque non molti lo sanno e di solito viene tenuto tranquillamente all'aria.
mmh, anch'io non lo sapevo, grazie per l'informazione! |
|
|
|
Ricciola
Nuovo Arrivato
38 Messaggi |
Inserito il - 10 febbraio 2009 : 09:49:36
|
ciao,
io concordo con i tutti i consigli che ti hanno dato gli altri, anche a me a volte succede.
volevo dirvi che io APS lo aliquoto e lo tengo a -20°C e lo scongelo e lo uso di volta in volta, in questo modo, per ora, non mi ha + dato problemi.
Prova a far polimerizzare il gel vicino ad una stufa, a volte si tratta di banalità ed è meglio così! |
|
|
|
moonycinzia
Utente Junior
234 Messaggi |
Inserito il - 10 febbraio 2009 : 16:53:14
|
Domanda stupida:la polvere dell'APS nel mio lab la teniamo in frigo nella sua bella boccetta.
La soluzione di APS al 10 % la teniamo lo stesso a 4%.
Non ho mai avuto problemi con il gel per SDS page mentre a volte, per gel denaturanti in urea, quando la temperatura ambiente è alta in Estate divento matta per avere dei bei pozzetti che non si rompano.
Può essere dovuto all'APS?
Tenendolo nella sua boccetta chiusa non dovrebbe assorbire acqua, o sì?
|
|
|
|
metrem
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
Inserito il - 29 settembre 2009 : 23:16:18
|
Scusatemi.. ho letto quanto avete già consigliato a aciredef, anche io ho problemi con la polimerizzazione. Ho aspettato più di 40 minuti e c'erano 29 gradi in stanza.. mi sono fatta prestare altro APS e sono riuscita a far polimerizzare il gel. Premetto che l'APS usato inizialmente lo avevo appena preparato, aliquotato e congelato. L'APS però è conservato in un armadio non con particolare cura. Non ha l'aspetto di polvere... più di blocco compatto!!E' normale?!?? O il fatto che si sia compattato è proprio dovuto all'umidità? Potrebbe essere quindi per questo che non funziona?
grazie in anticipo!!
|
|
|
|
GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 29 settembre 2009 : 23:44:21
|
Citazione:
Messaggio inserito da metrem
...O il fatto che si sia compattato è proprio dovuto all'umidità? Potrebbe essere quindi per questo che non funziona?
si esatto è quello!
In realtà quando lo pesi con esso pesi anche l'acqua che ha assorbito, quindi ci sarà meno APS di quello che serve (sarà ad una concentrazione inferiore) e per questo il gel non polimerizza.
In realtà aumentando la quantità di APS il problema si dovrebbe risolvere (come avevo fatto io, vedi risposta precedente), ma non puoi fare un calcolo preciso perchè non sai quanta acqua ha assorbito.
Comunque se c'è un po' più APS non fa niente, il problema è quando ce n'è meno, la polimerizzazione non avviene.
 |
|
|
|
_pietro_
Nuovo Arrivato
Città: Lund
104 Messaggi |
Inserito il - 06 ottobre 2009 : 11:04:25
|
Ciao,
mi inserisco nella discussione. Avete parlato di APS, del fatto di farlo nuovo ogni volta che si prepara un gel. Ora, io personalmente ne ho preparate diverse aliquote che tengo a -20. Sono mesi (tipo 5) che non ne preparo di nuovo e posso dire che, tra tutti i problemi che ho avuto, mai ma proprio mai ho avuto quello della mancata polimerizzazione. Mi chiedo se questa cosa dell'APS "freshly made" non sia un po' sopravvalutata.
Pareri? |
|
|
|
chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 06 ottobre 2009 : 11:13:36
|
Sicuramente se lo tieni a -20 sarà molto più stabile.
Di certo a Tamb ma anche a 4° dopo 3-4 gg non funziona più un gran che.
Poi ovviamente dipende da quanto ne metti, visto che come dicevo è semplicemente l'iniziatore radicalico. |
Sei un nuovo arrivato?
Leggi il regolamento del forum e presentati qui
My photo portfolio (now on G+!) |
|
|
|
memole
Utente Junior
Prov.: Brindisi
Città: brindisi
577 Messaggi |
Inserito il - 06 ottobre 2009 : 15:19:13
|
Ragazzi vi pongo un'altra questione. Noi utiluizziamo per la polimerizzazione del sodio tiosolfato al 5%. Il sale che utilizziamo per preparare la soluzione è pentaidrato. Vorremmo sapere se questo può influenzare la polimerizzazione. Premetto che di solito il gel polimerizza in almeno un'ora e mezzo almeno.
|
|
|
|
GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 06 ottobre 2009 : 16:41:27
|
@ _pietro_: si in questa discussione stavamo più che altro parlando del fatto che è igroscopico. Comunque a -20°C va benissimo.
Va preparato fresco ogni volta oppure una volta preparato aliquotato e conservato a -20°C ed è stabile per mesi, anche 1 anno (non sono mai arrivata così in là). Comunque anch'io lo tengo aliquotato a -20°C, il fatto però è che una volta scongelato non andrebbe ricongelato, o al massimo si può ricongelare una volta, di più non potrebbe funzionare.
Se lo tieni a Tamb sciolto di certo non è stabile e a 4°C lo può tenere per qualche giorno.
@memole: mi spiace ma non ho esperienza in questo |
|
|
|
memole
Utente Junior
Prov.: Brindisi
Città: brindisi
577 Messaggi |
Inserito il - 06 ottobre 2009 : 16:49:49
|
Grazie lo stesso!!!
|
|
|
|
_pietro_
Nuovo Arrivato
Città: Lund
104 Messaggi |
Inserito il - 06 ottobre 2009 : 20:05:57
|
@ GFPina: cara amica di Scandinavia, non so che dire, ma io lo tengo aliquotato in eppedorf tubes da 1,5 ml e mai ne uso più di 300ul a botta, per cui almeno 5 scongelamenti e ricongelamenti se li prende tutti e ripeto, mai problemi di polimerizzazione. Non dirmi che è solo culo, che tra tutte le sfighe che ho avuto e continuo ad avere, questa è l'unica cosa che mi ha sempre funzionato
PS_ non si parlava solo di igroscopicità dell'APS  |
|
|
|
chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 06 ottobre 2009 : 20:24:29
|
Non è questione di culo. Il fatto è che l'APS è sensibile all'umidità dell'aria (lo puoi leggere sull'MSDS se non mi credi).
Tu lo tieni a -20, quindi è ovviamente più stabile (come ti ha detto anche GFPina).
Ti assicuro che dopo 3-4 giorni in frigo non funziona più così bene (ma basta metterne un po' di più e sei a posto). |
Sei un nuovo arrivato?
Leggi il regolamento del forum e presentati qui
My photo portfolio (now on G+!) |
|
|
|
_pietro_
Nuovo Arrivato
Città: Lund
104 Messaggi |
Inserito il - 06 ottobre 2009 : 21:24:37
|
Dai, era scherzoso... con tutti i problemi che ho avuto e che continuo ad avere, sono solo stato autoironico..
|
|
|
|
Discussione |
|
il gel di poliacrilamide non polimerizza!!!
Didattica e Relazioni
