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FrancescaC
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 Inserito il - 13 febbraio 2009 : 16:26:24
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Ciao a tutti!!!  C'è qualcuno che mi saprebbe dire in cosa consiste la mutagenesi sito-specifica con oligonucleotidi mutati ?
Grazie mille!!!
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I rock. That's all |
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mikroula
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Lisa.ody
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 Inserito il - 14 febbraio 2009 : 10:29:16
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allora...si parte da un frammento di Dna a singolo filamento che vogliamo mutare. si inserisce questo frammento all'interno di un vettore M13. dopo ciò si utilizza un oligonucleotide complementare al frammento da mutare tranne che in un punto, corrispondente a una base.
a questo punto tramite una Dna polimerasi si sintetizza , partendo dall'oligo mutato che funge da innesco, il filamento complementare dell'intero vettore.
otterrai dunque un filamento wt e uno mutato.
questo nuovo vettore va utilizzato per la trasfezione di un sistema cellulare. verranno replicati filamenti wt e mutati. ci aspettiamo una resa del 50:50 ma non è così perchè il sistema cellulare che utilizziamo è di E.coli e questi mettono in atto un "meccanismo di riparazione" del Dna quando c'è una mutazione per cui alla fine otteniamo che l'efficienza di mutazione è molto bassa ovvero intorno al 10-20%.
per avere una maggiore efficienza di solito si utilizzano due strategia:
selezione del filamento mutato tramite una marcatura utilizzando il gruppo fosfotioato.
selezione con il metodo di Kunkel.
se ti serve la spiegazione di queste due strategie chiedi pure.
Allegato:  mutagenesi sito -specifica.doc
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chick80
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Mutagenesi sito specifica
Didattica
