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cicciput
Nuovo Arrivato
21 Messaggi |
 Inserito il - 21 febbraio 2009 : 16:25:46
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carissimi...
1 dubbio sulla costruzione di primers con code al 5' per la PCR. Il professore ci ha detto che, a partire dal ciclo successivo al primo, la coda sarŕ inglobata nell'amplicone, ma io mi chiedo: non č necessario inserire nella miscela di reazione altri primers in grado di appaiarsi alla nuova sequenza costituita dalla coda? Provo a spiegarmi meglio: (in rosso la coda)
3'aggctg5' qsto č 1 filamento da amplificare
5'aatttcctc...3' qsto č il primer con la coda
3'ttaaaggaggctg5' qsto č il prodotto dell'amplificazione
ora, come fa ad essere a sua volta amplificato questo strand se i primers originari non erano stati progettati per la sequenza della coda?
il mio dubbio ha senso?
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domi84
Moderatore
Cittŕ: Glasgow
1724 Messaggi |
Inserito il - 21 febbraio 2009 : 16:49:54
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Citazione:
Messaggio inserito da cicciput
il mio dubbio ha senso?
No, non ha senso.
Hai detto tu stesso che il primer con la coda č:
5'aatttcctc...3'
e che il frammento che si formerŕ č:
3'ttaaaggaggctg5
Come puoi notare i due filamenti (primer e amplificato) sono complementari...e appaieranno. D'altronde non poteva essere diversamente, visto che l'amplificato viene fuori complementare al primer...
Quindi, dov'č il tuo dubbio? |
Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato... |
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cicciput
Nuovo Arrivato
21 Messaggi |
Inserito il - 21 febbraio 2009 : 16:59:10
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non avevo pensato al fatto che TUTTI i primers dela miscela sono con la coda...sorry, sto fondendo per qsto esame.
grazie  |
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bububebč
Utente Junior
Prov.: Na
Cittŕ: Napoli
255 Messaggi |
Inserito il - 22 febbraio 2009 : 13:02:11
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Ciao a tutti ..
Potete aiutarmi a kiarire un pň le idee??
M sa ke sn un pň confusa su cm si fa a costruire una libreria di cDNa...
M kiedo infatti: il cDNA da utilizzare,deve essere ottenuto tramite RT-PCR partendo da un trascritto? ma soprattutto,una volta ottenuto sto cDNA,cm faccio ad inserirlo nei plasmidi x determinare amplificazione? cioč cm faccio a creare sul cDNA un sito di restizione? mah...
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cicciput
Nuovo Arrivato
21 Messaggi |
Inserito il - 22 febbraio 2009 : 18:38:42
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una volta ottenuto sto cDNA,cm faccio ad inserirlo nei plasmidi x determinare amplificazione? cioč cm faccio a creare sul cDNA un sito di restizione?
1 possibilitŕ:
uso di un vettore di clonaggio speciale dotato di sporgenze di A e che puň essere quindi legato a un prodotto di PCR come il cDNA ( che ha una coda di poly-T corrispondente al poly-A dell'mRNA)
2 possibilitŕ:
progettare primers che contengono siti di restrizione (includere il sito di restrizione in una breve coda al 5' di ciascun primer...queste estensioni non possono ibridare con il templato ma vengono copiate durante la PCR dando luogo a prodotti che portano siti di restrizione terminali).
Queste informazioni si trovano su "Biotecnologie molecolari" di Brown (pp 180,181,182)
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bububebč
Utente Junior
Prov.: Na
Cittŕ: Napoli
255 Messaggi |
 Inserito il - 22 febbraio 2009 : 18:59:39
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 ah ke bello!! capito tuttoooo!
grazie grazie!!
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cicciput
Nuovo Arrivato
21 Messaggi |
Inserito il - 22 febbraio 2009 : 19:11:38
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| felice d esserti stata utile...č la prima risposta ke do' in qsto forum...!!! |
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Dionysos
Moderatore
Cittŕ: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 22 febbraio 2009 : 19:38:24
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Citazione:
1 possibilitŕ:
uso di un vettore di clonaggio speciale dotato di sporgenze di A e che puň essere quindi legato a un prodotto di PCR come il cDNA ( che ha una coda di poly-T corrispondente al poly-A dell'mRNA)
Mhm questa perň mi suona strana... ma il cDNA non dovrebbe
essere trasformato in DNA a doppio filamento prima di essere
subclonato? non dovrebbe rimanere alcuna coda 'sporgente'. |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontŕ e della libertŕ
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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cicciput
Nuovo Arrivato
21 Messaggi |
Inserito il - 22 febbraio 2009 : 21:32:57
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mi sa proprio che hai ragione...comunque in questo caso:
nel fare il ds-cDNA la Taq aggiunge un residuo A al 3' quindi il vettore potrebbe essere costruito con sporgenze di T ai 5'. Che ne pensi? |
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GFPina
Moderatore
Cittŕ: Milano
8408 Messaggi |
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bububebč
Utente Junior
Prov.: Na
Cittŕ: Napoli
255 Messaggi |
Inserito il - 23 febbraio 2009 : 10:33:12
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In effetti č un pň un casino!!
Raga grazie!! cm siete carini ke mi aiutate !!
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GFPina
Moderatore
Cittŕ: Milano
8408 Messaggi |
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primers con code al 5'
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