Luciferase: conservazione lisato cellulare

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Autore

Discussione

Aidil
Nuovo Arrivato

Citt�: W�rzburg

2 Messaggi

Inserito il - 16 marzo 2009 : 16:45:09

Salve ragazzi, ho bisogno di voi!!

Devo effetuare una trasfezione transiente e usare il kit dual luciferase, abbiamo pero�un problema con il luminometro, serviranno un po�di gg per ripararlo.
Qualcuno di voi ha mai lisato le cellule con il lysis buffer e congelato il lisato in attesa di lettura?? Ho sempre usato effettuato l�analisi a momento!!! Se per favore mi dato qualche suggerimento. Inoltre lo conserverei a -80�C.
Grazie infinite

domi84
Moderatore

Citt�: Glasgow

1724 Messaggi

Inserito il - 16 marzo 2009 : 17:38:42

Mai fatto!!! Per� credo tu lo possa conservare a -80�C senza alcun problema.

Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato...

Schuldiner86
Utente Junior

Prov.: Viterbo
Citt�: Bologna

581 Messaggi

Inserito il - 16 marzo 2009 : 19:30:31

Se � un lisato penso che puoi conservarlo tranquillamente...Nel laboratorio dove ho fatto il tirocinio preparavano un botto di lisati e li congelavano tutti, poi li usavano per le analisi che dovevano fare quando potevano...

GFPina
Moderatore

Citt�: Milano

8408 Messaggi

Inserito il - 16 marzo 2009 : 20:11:20

Sinceramente non l'ho mai fatto, non ho idea se l'intensit� della luciferasi decada con il tempo durante il periodo di congelamento.
Io non mi fiderei tantissimo!!!
Prova a vedere in letteratura se trovi qualcuno che l'ha fatto su lisati congelati.

domi84
Moderatore

Citt�: Glasgow

1724 Messaggi

Inserito il - 16 marzo 2009 : 20:15:02

Citazione:
Messaggio inserito da GFPina

Sinceramente non l'ho mai fatto, non ho idea se l'intensit� della luciferasi decada con il tempo durante il periodo di congelamento.
Io non mi fiderei tantissimo!!!
Prova a vedere in letteratura se trovi qualcuno che l'ha fatto su lisati congelati.

Perch� dovrebbe decadere? Non � una proteina come altre?

Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato...

GFPina
Moderatore

Citt�: Milano

8408 Messaggi

Inserito il - 16 marzo 2009 : 21:18:56

Citazione:
Messaggio inserito da GFPina

Sinceramente non l'ho mai fatto, non ho idea se l'~~intensit�~~ attivit� della luciferasi decada con il tempo durante il periodo di congelamento.
Io non mi fiderei tantissimo!!!
Prova a vedere in letteratura se trovi qualcuno che l'ha fatto su lisati congelati.

Scusa ero di fretta, ho scritto intensit� al posto di attivit�!

Citazione:
Messaggio inserito da domi84
Perch� dovrebbe decadere? Non � una proteina come altre?

Beh � un enzima, non � detto che la sua attivit� non diminuisca con il congelamento.

Comunque facendo una rapida ricerca viene fatto anche su lisati congelati:
A new targeting approach for breast cancer gene therapy using the heparanase promoter.
Regulation of DeltaFosB transcriptional activity by Ser27 phosphorylation.
Mesothelin-mediated targeting of adenoviral vectors for ovarian cancer gene therapy.
Antisense phosphorodiamidate morpholino oligomer inhibits viability of Escherichia coli in pure culture and in mouse peritonitis.

Solo l'ultimo � free, ma in sostanza gli altri dicono che i lisati sono stati congelati a -80�C poi scongelati e centrifugati a 10000g per 15min o 12000g per 5 min e poi � stata misurata l'attivit� della luciferasi.

gilthanas
Nuovo Arrivato

100 Messaggi

Inserito il - 22 marzo 2009 : 12:23:14

Dipende dal tipo di kit che stai usando...

E' il dual reporter assay o il dual-glo luc assay??

C'� molta differenza tra uno e l'altro...

Nel primo caso se hai estratto le proteine con buffer PLB (Passive Lysis Buffer o qualsiasi altro buffer di lisi compatibile non c'� problema...congeli le proteine estratte a -80 o se vuoi -20 (meglio -80) e fai il saggio successivamente sulle proteine scongelate.

Se si tratta del secondo il problema � che il buffer di lisi contiene gi� il substrato della lciferasi e non saprei se il segnale decade oppure no...mai fatto...

jeje
Nuovo Arrivato

52 Messaggi

Inserito il - 27 marzo 2009 : 16:08:04

ciao io l'ho usato.:
lisi poi congelo in azoto e lascio a -80.
ho provato arileggere cose che avevo nel -80 da piu di un mese e l'attivit� della luc un pochino era diminuita.

Aidil
Nuovo Arrivato

Citt�: W�rzburg

2 Messaggi

Inserito il - 01 aprile 2009 : 15:47:43

Grazie a tutti!! Probabilmente compreremo un nuovo luminometro!!

In ogni caso il kit usato e�il dual report ( no substrato) e appena avro�occasione leggero�la luciferasi di questo esperimento!! anche per avere un�idea del tempo di conservazione!
Grazie ancora a tutti e a presto
Lidia