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maia84
Nuovo Arrivato
43 Messaggi |
 Inserito il - 26 marzo 2009 : 11:35:36
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Ciao a tutti!
Sapreste indicarmi un sistema che mi permette di valutare la quantità di ATP(prodotto sia per fosforilazione ossidativa che attraverso vie cataboliche)presente all'interno delle cellule batteriche??
Grazie mille!
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metionina
Nuovo Arrivato
Città: Cambridge
45 Messaggi |
Inserito il - 26 marzo 2009 : 20:58:23
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Che io sappia esiste il metodo della luciferasi.
In pratica si trattano i batteri con un tampone che contemporaneamente lisa e degrada le proteine: io usavo per i micobatteri Tris-EDTA e CTAB (ma non so con gli altri batteri con pareti meno spesse cosa si usi) e scaldavo un minuto a 100°C.
Poi al lisato con l'ATP cellulare estratta si aggiunge luciferasi e luciferina. La luciferasi è un enzima che usa l'ATP cellulare per ossidare la luciferina, e si ha contemporanea emissione di luce:
ATP + D-luciferin + O2 --> oxyluciferin + PPi + AMP + CO2 * light
la luce emessa è proporzionale all'ATP presente e viene misurata con un luminometro.
Insieme ai campioni si fanno anche le misura di alcuni standard a concentrazione di ATP nota. Bisogna farli ogni volta gli standard perchè la quantità di luce emissa può variare di molto a causa di mille fattori.
Una volta che si hanno le misure di luce emessa dagli standard, si fa una curva e si interpolano i risultati con la quantità di luce emessa dai campioni e si ottiene la concentrazione di ATP cellulare.
così avrai la concentrazione di tutta l'ATP presente nella cellula.
Se invece vuoi solo l'ATP prodotta dall'ATP cellulare allora è meglio fare delle vescicoli membranali invertite (si dice così in italiano??  ), il procedimento è un po' diverso ma si usa comunque la luciferasi.
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maia84
Nuovo Arrivato
43 Messaggi |
Inserito il - 29 marzo 2009 : 16:27:16
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Potrebbe essere un buon sistema in effetti...
Dato che tu hai già avuto modo di utilizzare questa tecnica ti dispiacerebbe inviarmi il protocollo che hai usato? Grazie in anticipo! |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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metionina
Nuovo Arrivato
Città: Cambridge
45 Messaggi |
Inserito il - 29 marzo 2009 : 16:39:40
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| dovrei già avere un protocollo più o meno scritto... appena ho un attimo lo aggiungo! |
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Livelli di ATP intracellulari
Didattica
?
