Livelli di ATP intracellulari

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maia84
Nuovo Arrivato

43 Messaggi

Inserito il - 26 marzo 2009 : 11:35:36

Ciao a tutti!
Sapreste indicarmi un sistema che mi permette di valutare la quantità di ATP(prodotto sia per fosforilazione ossidativa che attraverso vie cataboliche)presente all'interno delle cellule batteriche??
Grazie mille!

metionina
Nuovo Arrivato

Città: Cambridge

45 Messaggi

Inserito il - 26 marzo 2009 : 20:58:23

Che io sappia esiste il metodo della luciferasi.

In pratica si trattano i batteri con un tampone che contemporaneamente lisa e degrada le proteine: io usavo per i micobatteri Tris-EDTA e CTAB (ma non so con gli altri batteri con pareti meno spesse cosa si usi) e scaldavo un minuto a 100°C.
Poi al lisato con l'ATP cellulare estratta si aggiunge luciferasi e luciferina. La luciferasi è un enzima che usa l'ATP cellulare per ossidare la luciferina, e si ha contemporanea emissione di luce:

ATP + D-luciferin + O2 --> oxyluciferin + PPi + AMP + CO2 * light

la luce emessa è proporzionale all'ATP presente e viene misurata con un luminometro.

Insieme ai campioni si fanno anche le misura di alcuni standard a concentrazione di ATP nota. Bisogna farli ogni volta gli standard perchè la quantità di luce emissa può variare di molto a causa di mille fattori.
Una volta che si hanno le misure di luce emessa dagli standard, si fa una curva e si interpolano i risultati con la quantità di luce emessa dai campioni e si ottiene la concentrazione di ATP cellulare.

così avrai la concentrazione di tutta l'ATP presente nella cellula.

Se invece vuoi solo l'ATP prodotta dall'ATP cellulare allora è meglio fare delle vescicoli membranali invertite (si dice così in italiano??

), il procedimento è un po' diverso ma si usa comunque la luciferasi.

maia84
Nuovo Arrivato

43 Messaggi

Inserito il - 29 marzo 2009 : 16:27:16

Potrebbe essere un buon sistema in effetti...
Dato che tu hai già avuto modo di utilizzare questa tecnica ti dispiacerebbe inviarmi il protocollo che hai usato? Grazie in anticipo!

chick80
Moderatore

Città: Edinburgh

11491 Messaggi

Inserito il - 29 marzo 2009 : 16:33:17

E se hai tempo lo puoi anche aggiungere nella sezione protocolli del sito

?

Grazie.

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metionina
Nuovo Arrivato

Città: Cambridge

45 Messaggi

Inserito il - 29 marzo 2009 : 16:39:40

dovrei già avere un protocollo più o meno scritto... appena ho un attimo lo aggiungo!