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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
 Inserito il - 02 aprile 2009 : 10:40:36
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Buongiorno a tutti
Se non ricordo male tempo fa c'era quacuno che diceva di aver usato questo kit,io lo sto usando da un po' e sto avendo dei problemi in quanto la resa del plasmide a seguito della trasformazione usando il kit quiagen e' bassissima cioe' inutilizzabile !!
e' un problema solo mio?
cioe' i batteri con il wild type mi danno una resa ottima...ma appena li mutagenizzo,crescono una meraviglia...ma e' come se non avessero plasmide! e' come se passasse da Hight copy a low copy...
it's so strange !
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domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
Inserito il - 02 aprile 2009 : 14:07:50
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allora :
Il kit stratagene,lo uso per la mutagenesi e mi funziona perfettamente,
il kit quiagen lo uso pre fare la mini o la midi prep per estrarre il plasmide.... dove ho i batteri crescono una meraviglia,ma e' come se avessero appena un plasmide per cellula,e questo non succede con il wild type cioe' quello non trattato con il kit per la mutagenesi ,forse c'e' un problema nel kit che altera o il plasmide o il batterio ma non riesco a capire cosa |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 02 aprile 2009 : 14:20:32
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Se leggi bene le istruzioni ci sono molti consigli in questi casi.
io in genere aumento il tempo di elongazione da 1 min/kb fino a 2,5 min/kb
a volte funziona meglio con la quiksolution 1 ul, a volte 2 ul, ed a volte meglio senza.
Talvolta bisogna ridurre o aumentare il DNA di partenza da 2 ng, fino a 50 ed a volte 200 ng di plasmide wt
Prima di trasformare verifica prima su gel di agarosio il tuo campione senza e con Pfu, poi prima e dopo la digestione. In genere l'amplificato si vede molto bene.
Purifica con cloroformio/fenolo, precipita in alcool e trasforma
n. |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
Inserito il - 02 aprile 2009 : 14:30:14
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Si neuroscienze,noi la mutazione l'abbiamo inserita,abbiamo anche sequenziato da una PCR colony
,cosa potrebbe mai succedere aumentando il tempo di elongazione? dici che la pfu non sintetizzerebbe l'intero plasmide?
inoltre nel kit non c'e' la quiksolution...io uso 10 ng di DNA,ma il punto e' che i batteri crescono
cioe' vuol dire che il plasmide ce l hanno altrimenti non avrebbero la resistnza,ma e' proprio poco inutilizzabile
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metionina
Nuovo Arrivato
Città: Cambridge
45 Messaggi |
Inserito il - 03 aprile 2009 : 13:24:29
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| io ho sempre usato il kit stratagene per fare la mutazione, e il kit qiagen per la miniprep. sinceramente non ho mai avuto problemi di resa. escluderei quindi un problema di incompatibilità di kit o di reagenti |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 03 aprile 2009 : 15:26:38
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uhmm...
Bhé non so tu da dove prendi i batteri competenti,
io li preparo da solo per l'elettroporazione. Una volta mi capitò che avevo un ceppo contaminato ed il risultato era che la crescita era estremamente lenta, anche senza antibiotico, e la resa del plasmide era troppo scarsa.
Nel mio caso, cambiai ceppo e ne utilizzai uno nuovo e tutto andò liscio.
Se tu i batteri li compri tutto questo non ha senso.
Dividi il problema in due parti separate... ovvero
1) problema mutagenesi
2) problema di resa di miniprep o maxiprep
se hai risolto il problema 1, ed hai anche una quantità in 1-2 ng o 1-2 pg del plasmide... basta semplicemente trasformarlo e dovresti ottenere una buona resa.
Se al secondo punto non hai ancora una buona resa, mentre con il plasmide wt è tutto nella norma, il problema potrebbe essere una forma mutata dell'intero plasmide che rende difficile la duplicazione nel batterio. Ovvero hai accumulato nel plasmide la tua mutazione più altre mutazioni strane non volute.
Quindi di conseguenza il problema è di nuovo la mutagenesi fatta male.
1) non è vero che la velocità di sintesi di una Taq è indipendente dalla sequenza che codifica, ci sono diversi fattori che possono favorire o sfavorire la corsa, quindi alcune sequenze richiedono più tempo... in alcuni casi una forma mutata e più corta del plasmide sarebbe favorita rispetto a quella più lunga che vuoi ottenere tu.... aumentare il tempo di elongazione potrebbe diminuire la stringenza,
2) La quiksolution a volte risolve delle mutagenesi stranamente difficili, specialmente se poste in determinate sequenze orribili per disegnare una coppia di primers.
3) Variare la concentrazione del DNA iniziale può anche interferire con la resa finale del tuo plasmide, ma non sembra essere questo il caso tuo. Tieni conto però che allungare da 1 min/kb a 2,5 min/kb il tempo di elongazione ti distruggerebbe la resa della Pfu ai cicli finali... quindi hai un po' meno resa... se parti da un po' più di DNA iniziale, rischi un po' di background, ma tamponi questa perdita di resa nei cicli finali
ho scritto il testo di fretta... ci potrebbero essere degli errori grammaticali gravi
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
Inserito il - 03 aprile 2009 : 18:09:43
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innanzitutto grazie a tutti e a buon rendere....
I batteri non sono comprati ma hanno sempre funzionato con altri plasmidi ,quindi sto sicuro,le mie mutazioni sono mutazioni puntiformi di uno max 2 nucleotidi... l'unica cosa che faro' neuroscienze e' come dici tu aumentare il tempo di elongazione....non so che cambiera' ma tentar non nuoce :) ,
tuttavia oggi ho estratto a partire da 300 ml di batteri e continuando con il protocollo della midi ... e sono riuscito a precipitare qualcosa di utilizzabile
Per quanto riguarda la quik solution
non c'e' nel mio kit  |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 03 aprile 2009 : 20:34:07
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Forse non usi proprio il kit che ordinavo tempo fa...
In pratica ora compro direttamente la Pfu, DpnI ed i primers... con un risparmio di un migliaio di euro e risultato identico
Nel manuale on-line però c'è ancora http://www.stratagene.com/manuals/200521.pdf
ad ogni modo conosco un centinaio di trucchi per far uscire la mutagenesi stratagene, se non ti riesce ne riparliamo con calma, come ad esempio fare la PCR a 60°C invece di 55°C
La maggioranza dei suggerimenti li trovi sul link che ti ho scritto a pagina 15
n. |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
Inserito il - 03 aprile 2009 : 20:59:39
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si infatti l anniling dici tu vero?
no ma e' una bomba il kit ..cioe' l'altro giorno ne ho inserite 5 in un giorno!!! ,e tutte positive,ora me ne manca solo una dove non e' venuta proprio la trasfezione e mi sa che l anniling lo devo aumentare o abbassare..devo vedere,la stranezza e' solo nella resa,si puo' pensare che la pfu metta basi a cacchio nella ORI pero' e' strano ,cioe' considera che ho mutagenizzato sin ora 12 plasmidi ...
However mo mi vedo il manuale :)
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mollichina di pane
Utente Junior
121 Messaggi |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
Inserito il - 03 aprile 2009 : 21:26:44
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Si gioventu' io capisco che ognuno deve dire la sua
ma a me la mutazione c'e' ! 
e' il plasmide nelle cellule che e' poco ... |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 04 aprile 2009 : 02:39:29
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| E' riferito a tutto il post , presumo |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
Inserito il - 04 aprile 2009 : 09:59:33
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| sure |
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mollichina di pane
Utente Junior
121 Messaggi |
Inserito il - 04 aprile 2009 : 10:00:55
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ok...per le mini uso un altro kit...quando fai l'eluizione finale cosa usi? prova con l'acqua (non fredda) dopo averla fatta rimanere nella colonnina per un paio di minuti.
Poi...il kit stratagene non l'ho mai usato...alla fine prevede un passaggio di purificazione del prodotto?
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
Inserito il - 05 aprile 2009 : 09:31:56
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Per l'eluizione uso l'apposito buffer di eluizione :)
,il kit stratagene non prevede nessuno step di purificazione,
grazie a tutti comunque e buon lavoro
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kit mutagenesi stratagene
Didattica
