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biomolecola
Nuovo Arrivato
Prov.: Napoli
Città: Napoli
40 Messaggi |
 Inserito il - 20 marzo 2006 : 14:27:49
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Secondo voi riesco a visualizzare su agarosio al 4% bande che differiscono solo per 20 basi? I frammenti che ottengo da una digestione enzimatica sono di 130 e 20 basi. Il frammento non digerito è ovviamente lungo 150 basi. Poichè dubito di riuscire a vedere quello di 20 basi...ho paura di non riuscire a far separare bene gli altri 2!Che faccio?
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biomolecola
Nuovo Arrivato
Prov.: Napoli
Città: Napoli
40 Messaggi |
 Inserito il - 20 marzo 2006 : 14:30:42
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| P.S.: si tratta di almeno 200 campioni da genotipizzare per RFLP...COSTA TROPPO SEQUENZIARLI TUTTI!!!! |
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data
Nuovo Arrivato
Prov.: Torino
Città: Torino
89 Messaggi |
Inserito il - 20 marzo 2006 : 15:41:36
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| 130-120 secondo me se fai una corsa estenuante su un 3% (o anche di più, se vuoi controllo le concentrazioni precise che ho usato per purificare un frammentino di 100 bp tempo fa) o qualcosa del genere puoi anche farcela. Sui 20 non saprei. Per i gel molto concentrati io uso una miscela di agaroso normale insieme ad un agaroso low-melting point, in modo da poter colare il gel-cotica senza mettere l'etidio quando il tutto sta bollendo! |
http://www.medito.eu.org/vodka/odierno |
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biomolecola
Nuovo Arrivato
Prov.: Napoli
Città: Napoli
40 Messaggi |
Inserito il - 20 marzo 2006 : 15:53:12
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Grazie mille!
...cmq se riesci a farmi sapere le concentrazioni precise che hai usato tu mi faresti una grande cortesia! |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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AC
Nuovo Arrivato
45 Messaggi |
Inserito il - 20 marzo 2006 : 22:41:25
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anche secondo me devi provare con la poliacrilammide, anche perchè credo che un agarosio al 4% sia un pò difficile da fare, o hai qualche metodo?!
Ciao a tutti |
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biomolecola
Nuovo Arrivato
Prov.: Napoli
Città: Napoli
40 Messaggi |
Inserito il - 21 marzo 2006 : 10:50:24
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| poliacrilammide? ...200 campioni?...non mi dite queste cose!!!...posso anche sentirmi male!...e quando finisco? |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 21 marzo 2006 : 11:19:06
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Perche' scusa? Cosa ti cambia a fare un gel di agarosio o di polacrilammide? Comunque i campioni li devi caricare o su uno o sull'altro... e cmq se hai un gel dock abbastanza grande puoi caricare 40 campioni alla volta. |
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biomolecola
Nuovo Arrivato
Prov.: Napoli
Città: Napoli
40 Messaggi |
Inserito il - 21 marzo 2006 : 11:23:01
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| ..in genere quendo lo faccio al 12 %...ci mette almeno 3 ore per polimerizzare...e poi dovrei farli correre over night...altrimenti non separo assolutamente niente! |
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biomolecola
Nuovo Arrivato
Prov.: Napoli
Città: Napoli
40 Messaggi |
Inserito il - 21 marzo 2006 : 11:36:20
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| ...cmq mi sa che hai ragione!...il gel di poliacrilammide è la soluzione migliore |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 21 marzo 2006 : 12:24:23
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3 ore??? I miei gel x Western blotting polimerizzavano in 20 minuti circa... pero' credo dipenda dalle dimensioni e dallo spessore.
Ad ogni modo consolati, c'e' di molto peggio! (un esempio per tutti: in-situ hybridization con probe radioattiva -> 6 settimane di sviluppo e magari viene anche uno schifo! Sono esperienze che non consiglio... fidatevi!) |
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biomolecola
Nuovo Arrivato
Prov.: Napoli
Città: Napoli
40 Messaggi |
Inserito il - 21 marzo 2006 : 12:59:30
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i gel per western polimerizzano molto prima rispetto a quelli per DNA...
...cmq...sto facendo un tentativo con agarosio 4%...vediamo cosa ne viene fuori...
...adesso carico...
...e tra un'oretta vi faccio sapere!!!
CMQ GRAZIE PER IL SUPPORTO CHE MI STATE DANDO! |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 21 marzo 2006 : 17:09:51
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Io purtroppo sono bloccata a casa dall'influenza e non posso controllare il mio quaderno di laboratorio, ma anch'io ho avuto un problema simile in passato! Non ricordo esattamente ma i miei campioni differivano di circa 30bp tra tagliato e non tagliato, e la differenza la riuscivo a vederla anche in semplice gel di Agarosio al 2%. L'unico trucco è quello di far migrare i campioni molto lentamente. Se la tua cella elettroforetica è buona e i campioni migrano dritti nel tuo gel al 4% dovresti vederli sicuramente!
Buona Fortuna 
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biomolecola
Nuovo Arrivato
Prov.: Napoli
Città: Napoli
40 Messaggi |
Inserito il - 22 marzo 2006 : 12:30:36
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| OK!...si separano bene le 130 e 150!La banda da 20 nn si vede ma è poco importante...riesco agenotipizzare lo stesso! |
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DIGESTIONE ENZIMATICA
Didattica
