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roxy80
Nuovo Arrivato
21 Messaggi |
 Inserito il - 20 marzo 2006 : 17:28:36
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ciao a tutti,
c'è qualcuno che mi sa spiegare a cose servono queste soluzioni?
Binding Buffer che contiene 6 M guaninidine-HCl,10 mM urea,10mM Tris-HCl,20% Triton X-100 (v/v), pH4.4 (25°C)
Inhibitor Removal Buffer che contiene 5 M guanidine-HCl, 20 mM Tris-HCl, pH 6.6 (25°C) concentrazione finale dopo aver aggiunto etanolo assoluto
Wash Buffer che contiene 20 mM NaCl, 2 mM Tris-HCl, pH 7.5 (25°C) concentrazione finale dopo aver aggiunto etanolo
Elution Buffer che contiene 10 mM Tris-HCl, pH 8.5 (25°C)
che ruolo hanno nell'estrazione del DNA? 
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Roxy |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
 Inserito il - 20 marzo 2006 : 20:57:41
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Suppongo che siano i nomi di soluzioni commerciali...
Comunque binding buffer: guanidina-HCl e urea sono agenti caotropici, che servono probabilmente per denaturare le proteine. Triton X-100 e' un detergente che permette di rompere le membrane delle cellule da cui estrai.
Questo buffer lo metti probabilmente all'inizio prima di passare il tutto sulla colonna, quindi ti permette di liberare il DNA che potra' legarsi alla colonna.
L'Inhibitor Removal Buffer servira' potrebbe probabilmente servire per eliminare qualche inibitore delle DNAsi che c'era nel primo buffer? O comunque e' molto simile al binding buffer.
Il Wash Buffer serve semplicemente per lavare via tutto cio' che e' rimasto in colonna e che non sia DNA, l'etanolo credo si metta per far lavar via l'RNA.
Infine l'Eluition Buffer fa staccare il DNA dalla colonnina.
Nota che i pH delle soluzioni aumentano mano a mano e questo serve a far staccare dalla colonnina composti diversi. Ora non so esattamente di che resina siano fatte le colonne, ma e' sicuramente carica + (per legare il DNA). Aumentando il pH le cariche + sono neutralizzate e i composti si staccano mano a mano a seconda della loro affinita'.
Tutti i buffer, inoltre, contengono Tris-HCl che e' semplicemente usato per sospendere il DNA, poiche' in Tris e' piu' stabile che in acqua. Di solito alla fine risospendi in TE, che e' Tris-HCl + EDTA.
PS: non postare lo stesso messaggio in tutte le sezioni! Non ti preoccupare verra' letto comunque anche se lo mandi una sola volta (e l'ira funesta dei moderatori non ricadra' su di te!  ) |
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roxy80
Nuovo Arrivato
21 Messaggi |
Inserito il - 21 marzo 2006 : 18:14:09
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le colonnine sono provviste di un filtro di nitocellulosa.
dopo che ho messo il binding buffer e la proteinasi k, lascio incubare il tutto a 70 °C. Perchè? il calore accellera la denaturazione?
e subito dopo aggiungo isopropanolo. a che serve?
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Roxy |
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roxy80
Nuovo Arrivato
21 Messaggi |
Inserito il - 21 marzo 2006 : 18:18:14
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PS: perchè nella corsa elettroforesica metto TAE 1X invece del TBE?
grazie mille per i chiarimenti, ora mi è tutto più chiaro, e scusami per i troppi messaggi |
Roxy |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 21 marzo 2006 : 21:24:04
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Figurati!
La proteinasi k serve per digerire essenzialmente gli istoni e altre proteine e funziona meglio ad alte T. Inoltre a 70 gradi denaturi il DNA e probabilmente questo aiuta.
L'isopropanolo serve per far precipitare il DNA essenzialmente.
TAE e TBE vanno bene comunque per far correre il gel, sono semplicemente soluzioni elettrolitiche, che io sappia una vale l'altra.
PS: puoi usare il pulsantino "modifica messaggio" ( ) in cima al tuo topic se ti sei dimenticata di scrivere qualcosa!!!
ciao
nICO |
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fpotpot
Utente
Città: middleofnowhere
1056 Messaggi |
Inserito il - 22 marzo 2006 : 10:43:15
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| Tra TAE e TBE la differenza non è la percentuale di agarosio del gel?per quanto mi sembra di ricordare alta percentuale di agarosio (tipo più di 2-4%và meglio il TBE,mentre il TAE per gel a bassa percentuale di agarosio...is that correct? |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 22 marzo 2006 : 11:49:53
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La differenza tra TAE e TBE è dovuta alla loro diversa forza ionica. Il TBE ha una capacità tampone maggiore ed è più “resistente” alla elettroforesi, può essere utilizzato più volte, mentre il TAE si “esaurisce” prima. Per quanto riguarda la percentuale di gel non so. So però che il TBE è meglio per separare le bande a peso molecolare inferiore rispetto al TAE (hai una maggiore risoluzione), mentre con il TAE separi meglio le bande a peso molecolare maggiore (>2kb). Quello che dice fpotpot quindi credo sia corretto visto che per bande piccole si usa % di agarosio maggiore (quindi TBE) e viceversa. 
Ma in sostanza a meno che tu non abbia necessità di discriminare tra bande molto vicine non c’è una grossa differenza, un vale l’altro!
Per quanto riguarda l’estazione nICO ha risposto esaurientemente, l’unica mia aggiunta è che a quanto ne so l’Inhibitor Removal Buffer serve per rimuovere contaminanti che potrebbero inibire la PCR, inibitori della Polimerasi!
Spero che tutti i tuoi dubbi siano stati chiariti!
Ciao |
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