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Luminal
Nuovo Arrivato
Città: Reggio Calabria
53 Messaggi |
 Inserito il - 01 maggio 2009 : 10:04:32
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Copio e incollo qui il messaggio che avevo postato nella sezione tecniche, forse questa è la sezione più giusta e potete darmi una mano. Grazie!
C'è qualcuno che ha qualche esperienza con questo saggio enzimatico di citotossicità?
Io ci sto lavorando da 1 mese, ma non c'è verso che possa uscire... eppure devo riuscire a farlo a tutti i costi, ho già fatto fuori un intero kit della sigma!!!
Sto lavorando su sospensioni di epatociti (crioconservati di ratto), sui quali devo testare alcune sostanze. Uso il kit della SIGMA che fornisce il cofattore (Lattato), il substato (NAD+) e il sale di terazolio. Lo conservo a -20°C.
Ho provato a ridurre la densità cellulare, i tempi d'incubazione delle cellule con il composto (adesso aspetto un'ora, prima 3h), ad usare TRITON allo 0,5% anzichè a concentrazioni più alte, ma non c'è niente da fare...
Ho anche sostiuto la pipetta singola con quella multipla per ridurre i tempi e ultimamente uso anche qualche microgoccia di olio di silicone a bassa densità per rompere le bolle che inevitabilmente si formano prima della detecion allo spettrofotomentro. Nulla...
Ottengo curve che salgono e scendono, praticamente risultati assurdi.
Va meglio di prima però, quando sottraendo Low Control a High control ottenevo 0 o valori <0.
Non riesco ad allegarlo, quindi sotto copio e incollo il protocollo.
Ma prima un pò di background:
La quantità di LDH presente nel medium è una misura dell'integrità della membrana plasmatica. Più LDH si trova, maggiore è il danno cellulare, maggiore è la tossicità.
L'LDH, che troviamo nella glicolisi, catalizza l'ossidazione del lattato a piruvato con contemporanea riduzione del NAD+ a NADH, il piruvato formatosi reagisce poi con il sale di tetrazolio INT per dare formazano, che così come nell'MTT test viene rilevato per spettrofotometria.
1) Prepare LDH assay cofactor adding 25ml of Mq Water to LDH Assay Cofactor Preparation
Store it at -0°C.
2) Prepare Lactate Dehydrogenase Assay Mixture mixing equal amounts (1,1ml) of LDH Assay Substrate, Cofactor and Dye Solutions. Prepare assay mixture at time of use.
3) Thaw cryopreserved hepatocytes.
4) Re-suspend hepatocytes in DMEM at a density of 0,5 × 10 x 6 cells/mL.
5) Load hepatocytes/DMEM per well as the following:
- Background Control: Add 200#956;l of DMEM per well into triplicate wells (the background value has to be subtracted from all other values). *
- Low Control: 100#956;l of hepatocytes/DMEM per well into triplicate wells. Add 100 µl of DMEM more at the time of incubation.*
- High Control: 100#956;l of hepatocytes/DMEM per well containing 1% Triton X-100 into triplicate wells. Add 100 µl of DMEM (1% Triton X-100) more at the time of incubation.
- Test Sample: 100#956;l of hepatocytes/DMEM per well containing test substance (100µl) at different concentrations into triplicate wells.
*When required add DMSO #8804; 1%
6) Incubate cells in an incubator (5% CO2, 90% humidity, 37C°) for 1 hour.
7) Centrifuge cells at 170 g for 10 min to precipitate the cells.
8) Transfer the clear medium solution 50#956;l/well into an optically clear 96-well plate.
9) Add 100 #956;l Reaction Mixture to each well (an amount equal to 2X the volume of medium removed for testing to each sample). Reagents are added in the dark, with the hood light off.
10) Cover the plate with an opaque material to protect from light (e.g. aluminum foil or a box).
11) Incubate for up to 20 min at room temperature and in the dark.
12) The reaction can be terminated by the addition of 1/10 volume (15µl) of 1N HCl to each well.
13) Add 3,75µl of silicon oil (density: 0,92g/ml) to each well to pump the bubbles.
14) Spectrophotometrically measure absorbance at a wavelength of 490 nm. Measure the background absorbance of multiwell plates at 690 nm and subtract from the primary wavelength measurement.
15) Average the absorbance value of the wells containing assay buffer medium only and subtract this from the absorbance values of all the other wells.
Calculation of the Percentage Cytotoxicity:
(Test Sample - Low Control)
Cytotoxicity (%)----------------------------------------------- = X 100
(High Control - Low Control)
Notes:
It is recommended that a repeating pipettor be used to deliver reagents to the wells. This saves time and helps to maintain more precise incubation time.
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