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kaligari
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
 Inserito il - 21 marzo 2006 : 20:34:51
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Dovrei trovare un modo per la determinazione della sequenza all'estremità 5' di un generico mRNA.
Qualcuno ha qualche idea?
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fpotpot
Utente
Città: middleofnowhere
1056 Messaggi |
Inserito il - 22 marzo 2006 : 10:38:50
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 adesso dirò una cavolata:se tu partissi da un reverse primer vicino all'estremità 5 primo?cioè se retrotrascivi in un cDNA l'mRNA a partire dall'estremità della sequenza nota vicino all'UTR 5 primo,ottieni un mini cDNA che ha la sequenza iniziale+l'UTR..e poi amplifichi cDNA ottenuto in PCR e cloni in vettore e mandi a sequenziare...
HO DETTO UNA CAVOLATA super-scienziati?..(vi prego ditemi di no... ) |
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kaligari
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
Inserito il - 22 marzo 2006 : 17:26:20
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Grazie per la risposta.Si non mi sembra male.
Il fatto è che io non conosco nulla di questo mRNA,mentre per sequenziare la 3'UTR io avrei usato un primer di oligo dT e la transcittasi inversa e poi come hai detto tu.per la 5'UTR che primer uso se non conosco nulla della sequenza di mRNA?esistono primer universali?
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fpotpot
Utente
Città: middleofnowhere
1056 Messaggi |
Inserito il - 22 marzo 2006 : 19:17:45
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| ...avevo capito che conoscevi la seq di mRNA,non so se sia possibile avere primer universali per la seq di mRNA,a parte le utr,non sai se è omologo a qualche altro mRNA per quella proteina di altre specie o per proteine simili?magari da lì potresti provare a fare un primer in una parte conservata in varie specie della sequenza vicino a 5primo utr... |
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Ra1D
Utente Junior
Prov.: Bergamo
Città: Treviglio
174 Messaggi |
Inserito il - 22 marzo 2006 : 19:24:21
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Per il 3' conviene usare un oligodT e sfruttare la coda di polyA ...ma sorge un dubbio, come amplifichi con PCR se non hai un primer specifico interno?
Se non conosci la sequenza puoi fare una RT-PRC con random priming.
Di solito si usano primers corti, circa 6 nucleotidi, che hanno tutti i possibili nucleotidi ad ogni posizione.
Una volta sequenziata almeno una parte del tuo cDNA (mRNA), per ottenere precisamente il 5' e il 3' puoi fare una RACE-PCR
http://www.molecularlab.it/laboratorio/tecniche/race.asp
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...e vicinissimo al mio sapere si accampa la tenebra della mia ignoranza... |
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v_cetica
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 23 marzo 2006 : 14:16:45
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Io per amplificare regioni fiancheggianti a regioni note ho usato la tecnica Genome walking:
http://www.evrogen.com/t9.shtml
esistono dei kit, è molto carina! |
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kaligari
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
Inserito il - 23 marzo 2006 : 16:24:41
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Grazie davvero ragazzi,proverò!
Buona giornata! |
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Sequenziare una 5'UTR
Didattica
