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bioloGa4ever
Nuovo Arrivato
17 Messaggi |
 Inserito il - 08 giugno 2009 : 19:11:55
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Salve! qualcuno sa dirmi di preciso a cosa serve l'ultima fase di allungamento a 72°C per 10 minuti che si fa nella PCR dopo i 35 cicli? Grazie!
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 08 giugno 2009 : 19:32:35
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| Serve per finire di polimerizzare tutti i frammenti che non sono stati completati nei cicli precedenti. |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1915 Messaggi |
Inserito il - 08 giugno 2009 : 20:24:24
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addirittura voi la fate a 10 minuti?
mha...a chi 7 a chi 5 ...io molto spesso 3 |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 08 giugno 2009 : 21:17:55
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| ..dipende da quanto è lungo il frammento da "percorrere"... |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1915 Messaggi |
Inserito il - 08 giugno 2009 : 21:31:06
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in che senso Dionysos ?
se io ho un frammento tipo di 1kb, 5kb e 10kb ?
alla fine penso sia gia' sufficiente impostare il tempo di elongazione,per il resto questi minuti mi sono sempre sembrati un eccesso |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 08 giugno 2009 : 22:19:46
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Beh ci possono essere dei prodotti che non vengono completati per vari motivi, aggiungere uno step di allungamento finale ti assicura che tutti i prodotti non completati nei cicli precedenti vengano ultimati.
Ovviamente in base alla lunghezza del frammento che amplifichi non solo il tempo di allungamento nei vari cicli viene impostato di conseguenza, ma anche il tempo di allungamento finale può essere più lungo se i frammenti da amplificare sono più lunghi.
5 minuti in genere sono comunque sufficienti, ma portarlo a 7-10 min. ti da una certezza maggiore che tutti i prodotti incompleti vengano completati!
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gilthanas
Nuovo Arrivato
100 Messaggi |
Inserito il - 09 giugno 2009 : 12:45:01
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Beh soprattutto è fondamentale se dopo devi clonare il frammento amplificato e specie se lo vuoi usare successivamente in TA-cloning....
se è una PCR che serve per una risposta Yes/No si potrebbe anche evitare o accorciare molto....io lo metterei comunque magari molto accorciato.... |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 09 giugno 2009 : 16:08:53
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Ne approfitto per sottoporvi un dubbio che ho da tempo:
è vera 'sta storia che se il tempo di allungamento del ciclo
viene prolungato all'eccesso, la Pol non trova più nulla da
polimerizzare ed inizia a degradare gli amplificati
per sbilanciamento verso l'attività esonucleasica?
Cioè in parole povere : tempi di allungamento esagerati
possono portare ad abbassamenti nella resa ? |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 09 giugno 2009 : 23:01:35
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 mmm
interessante!
Sinceramente io questa cosa non l'ho mai sentita, ma potrebbe anche essere... la polimerasi si "annoia" dopo aver finito il lavoro e inizia a distruggere quello che ha fatto!  |
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Allungamento finale PCR
Didattica
