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ginestra88
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
 Inserito il - 07 luglio 2009 : 13:57:32
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ciao a tutti!!! studio biotecnologie e probabilmente le domande che vi pongo sono molto più semplici di quelle che ho letto nelle vostre discussioni, visto che ho bisogno di un aiuto solo per capire concetti basilari per l'esame di biologia molecolare 
argomento: PCR. quante molecole di DNA si ottengono per ogni ciclo di PCR? bisogna tener conto del fatto che solo dopo i primi tre cicli si ottengono due molecole di DNA DELLA REGIONE DI NOSTRO INTERESSE (porzione del DNA utilizzato che vogliamo amplificare)? secondo il mio ragionamento  solo a partire da queste due molecole si può dire che si otterranno 2 elevato alla n molecole di DNA della regione di nostro interesse, dove n= numero di cicli... o sbaglio?
inoltre come si inseriscono nella conta le due molecole di DNA AVENTI NUCLEOTIDI IN PIù RISPETTO ALLA REGIONE DI NOSTRO INTERESSE derivanti dai primi due cicli? 
come vedete sono confusa  e non riesco a trovare spiegazioni semplici che mi aiutino a capire questo concetto... ringrazio quell'anima pia che saprà darmele 
 P.s. scusate l'ignoranza!
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 07 luglio 2009 : 15:33:36
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Citazione:
bisogna tener conto del fatto che solo dopo i primi tre cicli si ottengono due molecole di DNA DELLA REGIONE DI NOSTRO INTERESSE (porzione del DNA utilizzato che vogliamo amplificare)?
Sì e no, perchè all'inizio tu puoi avere già diverse copie del tuo gene. Quindi al terzo ciclo non hai 2 copie della regione di interesse, ma molte di più.
In generale partendo da C copie, dopo n cicli otterrai C^(n-2) copie della regione di interesse. [EDIT: in realtà questa formula non è corretta, vedere risposte successive]
Citazione:
inoltre come si inseriscono nella conta le due molecole di DNA AVENTI NUCLEOTIDI IN PIù RISPETTO ALLA REGIONE DI NOSTRO INTERESSE derivanti dai primi due cicli?
E' da lì che deriva il -2 della formula che ho scritto sopra.
Nota che questo vale solo per la fase di amplificazione esponenziale, verso la fine il conto non sarà più quello. In generale quindi puoi anche approssimare a C^n, tanto comunque saranno entrambi calcoli sbagliati! 
Citazione:
P.s. scusate l'ignoranza!
Non c'è alcun bisogno di scusarsi, sono domande più che legittime, anzi mostrano che ci hai ragionato su! |
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ginestra88
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 07 luglio 2009 : 18:32:07
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ciao chick80!ti ringrazio per la rapidità con cui mi hai risposto e per la tua disponibilità !
c'è qualcosa che dovrei ancora chiederti :D...ammesso che si abbiano diverse copie del gene, comunque 'la conta' del numero di cicli che bisogna elevare a C ha inizio a partire dal quarto ciclo, visto che solo dopo 3 cicli si ottengono molecole di DNA coincidenti con il gene di nostro interesse? forse mi hai già risposto ma non sono sicura di aver capito
altra domanda : le due molecole di DNA aventi nucleotidi in più rispetto alla regione di nostro interesse derivanti dai primi due cicli, non subiscono comunque la reazione della PCR, e quindi non daranno anch'esse molecole di DNA coincidenti con la regione di nostro interesse che potrebbero a loro volta dare origine a più copie?
P.s. hai ragione,niente scuse.. questo forum è davvero utile!grazie |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 07 luglio 2009 : 18:41:31
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Citazione:
qualcosa che dovrei ancora chiederti :D...ammesso che si abbiano diverse copie del gene, comunque 'la conta' del numero di cicli che bisogna elevare a C ha inizio a partire dal quarto ciclo, visto che solo dopo 3 cicli si ottengono molecole di DNA coincidenti con il gene di nostro interesse
Beh, al terzo ciclo cominci già ad ottenere l'amplificato di interesse. E' per quello che ho scritto C^(n-2) cioè togli i primi 2 cicli dalla conta.
Citazione:
le due molecole di DNA aventi nucleotidi in più rispetto alla regione di nostro interesse derivanti dai primi due cicli, non subiscono comunque la reazione della PCR, e quindi non daranno anch'esse molecole di DNA coincidenti con la regione di nostro interesse che potrebbero a loro volta dare origine a più copie?
Certo, ma quelle molecole crescono in modo lineare, mentre le molecole del frammento amplificato crescono in maniera esponenziale, quindi dopo pochi cicli le molecole più lunghe saranno molte meno e sarà statisticamente meno probabile che vengano amplificate. |
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ginestra88
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 08 luglio 2009 : 12:10:10
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allora...sul primo punto ci sono  ora ho capito a cosa si riferisce quel (-2)! sul secondo punto ho ancora qualche dubbio 
puoi spiegarmi come mai le molecole più lunghe crescono in maniera lineare e non esponenziale? per il fatto che si originano nei primi due cicli e quindi la loro "moltiplicazione" sarà molto inferiore rispetto a quella delle molecole a lunghezza unitaria?
GRAZIEEEE ANCORA!!! |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 08 luglio 2009 : 13:46:34
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Allora, facciamo un esempio partendo da 1 solo frammento di DNA contenente il tuo gene.
All'inizio hai 1 copia "lunga" (dove le x sono il tuo target):
-----------xxxxxxxxxxx--------------
-----------xxxxxxxxxxx--------------
Ciclo 1: hai la copia lunga originale + 1 copia "intermedia" con le code laterali
-----------xxxxxxxxxxx--------------
-----------xxxxxxxxxxx--------------
-----------xxxxxxxxxxx
xxxxxxxxxxx--------------
Ciclo 2: L'amplificazione dell'originale ti darà 1 altra copia intermedie e l'amplificazione di quella intermedia ti darà il tuo frammento di interesse.
-----------xxxxxxxxxxx-------------- originale
-----------xxxxxxxxxxx--------------
-----------xxxxxxxxxxx intermedia (del ciclo 1)
xxxxxxxxxxx--------------
-----------xxxxxxxxxxx intermedia (del ciclo 2)
xxxxxxxxxxx--------------
xxxxxxxxx frammento di interesse!
xxxxxxxxx
Ciclo 3: otterrai ancora 1 copia intermedia dall'originale, più 2 copie del frammento di interesse dalle intermedie che già avevi + 1 copia del frammento di interesse dal frammento già ottenuto.
Ciclo 4: l'originale crea un'altra copia intermedia, nel ciclo 3 hai ottenuto 3 copie intermedie che quindi daranno altri 3 frammenti di interesse + 2 frammenti di interesse ottenuti dall'amplificazione di quelli già presenti
...
etc etc
Se facciamo una tabellina di quanti frammenti dei vari tipi ci siano otteniamo:
Ciclo | Originale | Copie con "code" | Frammento di interesse
---------+----------------+-------------------------+---------------------------
0 | 1 | - | -
1 | 1 | 1 | -
2 | 1 | 2 | 1
3 | 1 | 3 | 4
4 | 1 | 4 | 11
5 | 1 | 5 | 26
6 | 1 | 6 | 57
7 | 1 | 7 | 120
Come vedi le copie con le code salgono linearmente perchè le ottieni solo amplificando l'originale (che è sempre 1 copia).
I frammenti di interesse invece salgono in modo esponenziale, in quanto li ottieni sia dalle copie con le code sia dai frammenti di interesse generati nel ciclo precedente.
Al passare dei cicli il contributo dei frammenti con le code diventa veramente irrilevante rispetto a quello del tuo amplificato.
Il discorso è lo stesso partendo da n copie originali, solo che i numeri saranno più alti! |
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ginestra88
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 08 luglio 2009 : 23:59:18
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domanda... per "originale" intendi il duplex contenente la regione da amplificare da cui si parte ( che non ha ancora subito alcun ciclo di PCR)? ti faccio questa domanda perchè il mio ragionamento filerebbe con il tuo se per originale si intendesse invece la molecola di DNA ( copia singola) ottenuta dal primo ciclo, avente comunque code laterali, ma più lunga di quella che si ottiene dal secondo ciclo ( che non coincide ancora con il frammento di interesse)... e quindi il ciclo che tu indichi come 0 dovrebbe essere il primo.. così si otterrebbe il frammento di interesse solo dal terzo ciclo.
scusa l'insistenza! ti ringrazio della lunga e dettagliata spiegazione seguendola sono riuscita a capire il procedimento, solo non mi ritrovo con i soggetti
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 09 luglio 2009 : 01:03:47
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Citazione:
Messaggio inserito da ginestra88
domanda... per "originale" intendi il duplex contenente la regione da amplificare da cui si parte ( che non ha ancora subito alcun ciclo di PCR)?
Si per originale si intende lo stampo! Il DNA da cui parti prima dell'amplificazione.
Citazione:
Messaggio inserito da ginestra88
... il mio ragionamento filerebbe con il tuo se per originale si intendesse invece la molecola di DNA ( copia singola) ottenuta dal primo ciclo, avente comunque code laterali, ma più lunga di quella che si ottiene dal secondo ciclo ( che non coincide ancora con il frammento di interesse)...
No quelle sono state indicate come Copie con "code"!
Però sinceramente non capisco dove non ti trovi.
Riprendendo il disegno di chick80 (tanto gli copio sempre i disegnini!  )
-----------xxxxxxxxxxx--------------
-----------xxxxxxxxxxx--------------
All'inizio hai questo, e i primers si appaieranno in questo modo:
-----------xxxxxxxxxxx--------------
<-- xxx
xxx -->
-----------xxxxxxxxxxx--------------
generando le copie con code:
-----------xxxxxxxxxxx-------------- ORIGINALE
-----------xxxxxxxxxxx--------------
xxxxxxxxxxx-------------- COPIE CON CODE
-----------xxxxxxxxxxx
e qua siamo al primo ciclo!
Poi al secondo ciclo avrai che i primers si appaiano all'originale e alle copie con code in questo modo:
-----------xxxxxxxxxxx--------------
<-- xxx
xxx -->
-----------xxxxxxxxxxx--------------
xxxxxxxxxxx--------------
<-- xxx
xxx -->
-----------xxxxxxxxxxx
generando:
-----------xxxxxxxxxxx-------------- ORIGINALE
-----------xxxxxxxxxxx--------------
xxxxxxxxxxx-------------- COPIA CON CODE (Generata nel 1° ciclo)
-----------xxxxxxxxxxx
xxxxxxxxxxx-------------- COPIA CON CODE (Generata nel 2° ciclo)
-----------xxxxxxxxxxx
xxxxxxxxxxx FRAMMENTO DI INTERESSE
xxxxxxxxxxx
Quindi dal 2° ciclo tu hai il frammento di interesse e da quel momento "parte" il conto il frammento di interesse viene amplificato in modo esponenziale.
L'originale rimarrà sempre uguale, quindi sempre 1!
E le copie con code aumentano in modo lineare, perchè si formano "solo" dall'originale (che è sempre 1, quindi se ne forma una nuova ad ogni ciclo)
Da qui la tabellina che ha scritto chick80!
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ginestra88
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 09 luglio 2009 : 09:59:08
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provo a spiegare perchè non mi ritrovo... il problema è a monte:
i prodotti del primo ciclo dovrebbero essere una sorta di ibridi... mi aiuto anche io con i disegnini ispirandomi ai vostri:
prodotti del primo ciclo:
-----------xxxxxxxxxxx--------------
xxxxxxxxxxx--------------
-----------xxxxxxxxxxx
-----------xxxxxxxxxxx--------------
quindi ciascun prodotto duplex, dovrebbe avere eliche di lunghezza diversa, giacchè l'estensione dei primer appaiatisi nella fase di annealing, è avvenuta utilizzando come stampo un'elica originale per ciascun primer.
lo stesso vale per gli altri cicli.. prodotti del secondo ciclo:
xxxxxxxxxxx--------------
xxxxxxxxxxx
xxxxxxxxxxx
-----------xxxxxxxxxxx
e in più ci sono i prodotti derivanti dalle eliche originali (derivate dal processo di denaturazione dei prodotti del primo ciclo) che danno, amplificate, gli stessi prodotti ottenuti nel primo ciclo.*
prodotti del terzo ciclo:
xxxxxxxxxxx
xxxxxxxxxxx
xxxxxxxxxxx
xxxxxxxxxxx
quindi si otterrebbero due copie del frammento di interesse solo con il terzo ciclo.
in più ci sono i prodotti derivanti dalle eliche contenenti il frammento di interesse + la coda laterale che danno, amplificate, gli stessi prodotti ottenuti nel secondo ciclo (quelli disegnati);
in più ci sono i prodotti derivanti da * che sono gli stessi prodotti del secondo ciclo (quelli disegnati) più gli stessi prodotti del primo.
in realtà forse come dite voi è la stessa cosa perchè comunque le eliche risultanti dall'estensione dai primers sono tra di loro complementari e i risultati numerici sono gli stessi...ma insisto perchè sul libro che sto usando è scritto che si ottengono frammenti di interesse solo dal terzo ciclo, e poi perchè altrimenti come si spiegherebbe la formula : C elevato alla (n-2)?dov'è che sbaglio??
VI RINGRAZIOOOOOO TANTOOOO!!!!
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ginestra88
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 09 luglio 2009 : 10:01:21
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| scusate non so usare bene il computer...e sono venute sfalsate le eliche... in realtà il frammento di iteresse di un' elica di ciascun duplex deve essere allineato con quello dell'altra elica |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 09 luglio 2009 : 12:49:48
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Ho aggiustato i disegnini. Per mantenere la formattazione usa il tag code (vedi questa pagina per più informazioni su come formattare i tuoi messaggi sul forum!).
Credo tu ti stia perdendo in un bicchiere d'acqua 
Tu dici che i prodotti del primo ciclo sono:
-----------xxxxxxxxxxx--------------
xxxxxxxxxxx--------------
-----------xxxxxxxxxxx
-----------xxxxxxxxxxx--------------
Noi diciamo che sono
prodotti del primo ciclo:
-----------xxxxxxxxxxx--------------
-----------xxxxxxxxxxx--------------
-----------xxxxxxxxxxx
xxxxxxxxxxx--------------
Se vedi bene è esattamente la stessa cosa. Probabilmente la seconda situazione è statisticamente più probabile in quanto il duplex completo sarà più stabile, ma alla fin della fiera poco importa tanto l'amplificazione si fa quando il DNA è denaturato, quindi non ci interessa sapere chi si appaia con chi alla fine di ogni ciclo.
Citazione:
lo stesso vale per gli altri cicli.. prodotti del secondo ciclo:
xxxxxxxxxxx--------------
xxxxxxxxxxx
xxxxxxxxxxx
-----------xxxxxxxxxxx
e in più ci sono i prodotti derivanti dalle eliche originali (derivate dal processo di denaturazione dei prodotti del primo ciclo) che danno, amplificate, gli stessi prodotti ottenuti nel primo ciclo.*
Verissimo!
Ancora una volta tu le hai allineate così:
xxxxxxxxxxx--------------
xxxxxxxxxxx
xxxxxxxxxxx
-----------xxxxxxxxxxx
e noi così:
xxxxxxxxxxx--------------
-----------xxxxxxxxxxx
xxxxxxxxxxx
xxxxxxxxxxx
Ma è la stessa cosa una volta che li denaturi. |
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cicli PCR
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