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cin
Utente Junior
Prov.: Padova
Città: Padova
558 Messaggi |
 Inserito il - 18 aprile 2006 : 14:07:09
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Vi è mai capitato di avere l'efficienza di una reazione di real time superiore al massimo? Sapreste darmi una spiegazione del perchè, di come sia possibile essere più efficienti del valore massimo?  Riesco a comprendere le cause di una bassa efficienza, ma il contrario no.
Grasssie
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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cin
Utente Junior
Prov.: Padova
Città: Padova
558 Messaggi |
 Inserito il - 19 aprile 2006 : 14:14:54
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Pensavo che tutti si esprimessero in questi termini.
Lavoro con il Syber Green e con l'OPTICON 2 dell'MJ.
Quando ho valori di questo genere sopra la retta standard:
C(T) Control Graph Y=-0.30x +9.83;r^2=0.994
e i vari punti della retta sono distanziati in maniera corretta,
siamo al massimo dell'efficienza.
Quando ho valori di questo genere:
C(T) Control Graph Y=-0.35x + 14.18; r^2=0.992
siamo oltre il massimo dell'efficienza
Quando ho valori di questo genere:
Y=-0.24x+ 10.16; r^2=0.994
abbiamo una bassa efficienza
ovvero ho una massima efficienza con valori
di Y= -0.30
Volevo inserire un grafico per far capire meglio,
ma non mi è possibile, perchè quando la real sta andando
non riesce a fare nient'altro. Appena posso lo farò.
Spero di essermi spiegata, ma son sicura di no
Ciao
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 19 aprile 2006 : 15:51:20
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Ah ok... ho sempre lavorato con TaqMan, non ho mai usato il SYBR Green e' per quello che non mi tornava! :D
Comunque credo che il problema sia puramente matematico. L'equazione che ottieni e' una retta interpolata da un certo numero di punti suppongo, quindi e' un risultato che approssima l'andamento della situazione, e a volte puo' darti risultati al di sopra del massimo.
Questa ovviamente e' una mia supposizione... ripeto non ho mai usato il SYBR Green |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 02 maggio 2006 : 16:03:14
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Ciao!
Io sto iniziando ad utilizzare la Real Time con il sybr Green... non sono un'esperte perchè sono agli inizi, ma ho da poco seguito il corso per l'utilizzo dello strumento e spulciando i miei appunti ho trovato la risposta alla tua domanda:
Se ho una E>100% può essere che ho dei primers non specifici e sto amplificando qualche cos'altro oltre al mio templato, oppure può essere dovuto ad un errore sistematico (x. es pipetta starata) se è del 2-5% maggiore del massimo.
Comunque una efficienza tra 95-105% è buona!
Questo è quello che ho trovato.
In effetti l'efficienza è la pendenza della curva, quindi penso che chik80 abbia ragione.
Ciao |
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cin
Utente Junior
Prov.: Padova
Città: Padova
558 Messaggi |
Inserito il - 02 maggio 2006 : 16:30:24
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grazie ad entrambi, ne parleremo alla riunione di lab e vediamo cosa ne verrà fuori. |
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Cangrande
Utente Junior
Prov.: Verona
280 Messaggi |
Inserito il - 03 maggio 2006 : 10:57:48
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| Hai provato a fare un pcr prova facendola poi correreb su gel d'agarosio 2%. Così vedrai la presenza di aspecifici.... A me è successo |
Magnifico atque victoriosissimo Domino, Domino Kani Grandi de la Scala. |
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cin
Utente Junior
Prov.: Padova
Città: Padova
558 Messaggi |
 Inserito il - 03 maggio 2006 : 12:18:14
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Ma intendi dire di seminare i punti della curva standard?
Di solito se non ci sono problemi tipo H2O positive o campioni con Melting strana non lo facciamo, tanto meno se ho tutto OK con un'efficienza alta.
Comunque ci è venuto in mente che il problema potrebbe essere legato ad un altro fattore, sto facendo delle prove, vi saprò dire..... |
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cin
Utente Junior
Prov.: Padova
Città: Padova
558 Messaggi |
 Inserito il - 10 maggio 2006 : 16:01:14
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| Le prove consistevano nel diluire ulteriormente i primers,li ho diluiti 1:3, poi ho ripetuto diluendo ulterirmente di 1:3, ma non è cambiato un fico secco; bè stanno riscrivendo i primers..... |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 10 maggio 2006 : 17:09:57
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Beh allora è plausibile che il problema sia che i primers non siano specifici e ti amplifichino qualche cos'altro... non hai poi provato a seminare su gel come suggeriva Cangrande???
Comunque se è così con dei nuovi primers dovresti risolvere il problema!
In bocca al lupo! |
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calimero
Nuovo Arrivato
Prov.: Verona
Città: verona
2 Messaggi |
Inserito il - 12 maggio 2006 : 14:34:15
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ciao,
l'effiecienza di una reazione si misura a partire dall'amplificazione degli standard e da essa dipende la retta di taratura che ottieni: per esempio se fai diluizioni seriali decimali la distanza tra cicli soglia consecutivi deve essere 3,3 (numero che si ricava dall'equazione matematica che descrive la quantificazione in la real-time, la trovi facilmente in letteratura). Se per motivi legati alla cinetica della reazione (scelta primer, magnesio, forza ionica etc) il valore di 3,3 non viene rispettato l'efficienza varia: in particolare se la distanza tra i cicli soglia consecutivi dei tuoi standard è inf. a 3,3 l'eff. sarà sup al 100%; al contrario avrai eff. inf al 100% per distanze superiori a 3,3. I motivi di ciò sono squisitamente matematici, anche se riflettono diverse dinamiche di reazione, che al contrario vanno come vogliono loro!
L'efficienza determina la pendenza della retta di taratura, e questa la quantificazione dei tuoi campioni. Cerca quindi di stare sempre vicino a 100 per essere sicura di quant. bene
Controlla i tuoi amplificati ed escludi la presenza di prodotti aspecifici, acquisisci il segnale 2-3 gradi sotto la melting del tuo frammento, fatto ciò vai tranquilla!
buon lavoro |
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cin
Utente Junior
Prov.: Padova
Città: Padova
558 Messaggi |
Inserito il - 16 maggio 2006 : 15:20:35
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| Grazie |
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cristiano
Nuovo Arrivato
Prov.: Novara
Città: novara
37 Messaggi |
Inserito il - 17 maggio 2006 : 15:54:34
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| Bene, io ho una distanza tra cicli soglia consecutivi, nelle diluizioni seriali decimali, inferiore a 1, quando va bene, se no è 0 o addirittura il Ct è inferiore più il campione è diluito. Ho caricato su gel e non ci sono aspecifici, a parte il bandone di dimeri di primer che mi porto sempre dietro. In compenso il controllo negativo, o bianco, a un Ct a circa 17 cicli. Che faccio? |
CRI |
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cin
Utente Junior
Prov.: Padova
Città: Padova
558 Messaggi |
Inserito il - 18 maggio 2006 : 09:53:14
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| Quante paia di basi sono i tuoi primers? |
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cristiano
Nuovo Arrivato
Prov.: Novara
Città: novara
37 Messaggi |
Inserito il - 19 maggio 2006 : 09:14:59
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| 21 il forward 25 il reverse |
CRI |
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cin
Utente Junior
Prov.: Padova
Città: Padova
558 Messaggi |
Inserito il - 22 maggio 2006 : 13:09:30
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Scusa, ho sbagliato la domanda:volevo dire quante paia di basi è il tuo amplificato?
Se ho capito bene al posto di avere all'incirca 3 cicli tra uno standard ed un altro diluito dieci volte di più rispetto al primo,hai solo un ciclo?
Ed in sostanza il controllo negativo ti viene positivo? Cosa metti H2O o solo mix?
Bè se è così,la prima cosa che mi verrebbe da fare nel tuo caso sarebbe quella di diluire ulteriormente i primers. |
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cristiano
Nuovo Arrivato
Prov.: Novara
Città: novara
37 Messaggi |
Inserito il - 23 maggio 2006 : 11:49:44
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l'amplificato è di 339bp e i primer sono già abbastanza diluiti credo, lavoriamo con conc 0,15 uM. Il problema del controllo negativo (H2O + mix) è probabilmente dovuto a contaminazioni (spero), la prox volta provo a usare i puntali col filtro e vediamo.
Il dubbio che mi è sorto è questo: io parto da una concentrazione ignota di DNA e preparo una diluizione 1:10 e una 1:100 e dovrei trovare una differenza di cicli soglia tra una diluizione e l'altra di 3.3. Ma se il mio DNA di partenza è molto molto concentrato, mi bastano 2 diluizioni per vedere questa differenza? ci sarà un limite al di sopra del quale questa regola non vale più, altrimenti, in via teorica, a concentrazioni elevatissime corrisponderebbero Ct di 3-4, che mi sembra un po' poco.
Aggiungo in ogni caso che non ho mai seguito corsi di real time (ma lo faro' al più presto prometto!) per cui la mia ignoranza in materia è del tutto giustificata. |
CRI |
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cin
Utente Junior
Prov.: Padova
Città: Padova
558 Messaggi |
Inserito il - 23 maggio 2006 : 14:28:31
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Io lavoro con il c-DNA, ma penso sia lo stesso; in effetti, nel costruirmi la curva, mi è successo di partire da uno standard troppo concentrato ed in effetti quando tra il primo ed il secondo punto di standard non c'era il giusto numero di cicli e nelle successive diluizioni invece sì, lasciavo perdere le prime diluizioni e mi spingevo verso il basso.
Normalmente facciamo una prova primers dove valutiamo la diversa concentrazione dei primers; successivamente una "prova di efficienza" dove mi costruisco una curva a diluizioni scalari 1:10 oppure 1:5 a seconda dei casi ( se esce presto, tipo attorno ai 20 cicli opto per l'1:10, se verso i 30 cicli invece uso l'1:5) e faccio da 5 anche a 7 diluizioni consecutive.
Il problema degli standard è che ne devi usare uno molto espresso per i tuoi campioni, affinchè stiano nella curva.
Noi lavoriamo solo con puntali con il filtro e dopo aver perso un tempo immane a causa delle contaminazioni abbiamo separato fisicamente ( tramite due stanze distine) la zona pre da quella post-PCR ed abbiamo risolto tutti i problemi.
Noi usiamo il syber green.
Il tuo amplificato è un pò grande per la real,da quel che mi risulta sarebbe bene non superare le 200 bp, non so se ciò è legato al syber.
In effetti noi lavoriamo ad una concentrazione di primers di 1.2uM iniziale (prima di metterli nella mix di reazione)che equivalgono a 0.3uM finale nella mix.
Be', anch'io non ho mai fatto un corso, e si vede....vorrei fare quello della Biorad, ma oltre ad essere costoso dura 4 giorni e questo mi causa dei problemi, comunque da quel che mi pare di capire nel mio approccio alla real è che impari moltissimo sul campo e che l'esperienza o i consigli di chi ti sta vicino ti danno molto più di un qualsiasi corso.
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barbapapà
Nuovo Arrivato
10 Messaggi |
Inserito il - 19 febbraio 2007 : 15:41:57
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A distanza di quasi un anno, posso chiedere a cin come ha risolto il suo problema? e cristiano?
Grazie
ciao
barbapapà |
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283
Nuovo Arrivato
115 Messaggi |
Inserito il - 30 luglio 2012 : 23:11:29
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se fai diluizioni seriali decimali la distanza tra cicli soglia consecutivi deve essere 3,3 (numero che si ricava dall'equazione matematica che descrive la quantificazione in la real-time, la trovi facilmente in letteratura).
ciao!
anche se sn passati molti anni ho trovto la tua risposta molto utile (grazie)..ma non sn riuscita a trovare nulla al proposito in letteratura..sapresti dirmi dove l'hai trovato?
grazie per la tua disponibilità |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 31 luglio 2012 : 00:24:23
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Per favore se citi la risposta di qualcuno utilizza il tag "quote" o quantomeno utilizza le virgolette!
Citazione:
Messaggio inserito da 283
..ma non sn riuscita a trovare nulla al proposito in letteratura..sapresti dirmi dove l'hai trovato?
Su un qualunque manuale di real-time lo trovi! Il numero esatto è 3,322 è la stessa identica cosa che spiegavo qui: http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=26367#126687
e non è altro che, come detto anche da calimero, una pura questione matematica.
2^n = 10 |
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283
Nuovo Arrivato
115 Messaggi |
Inserito il - 31 luglio 2012 : 08:07:09
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la citazione è un problema che cn il mio pc ma farò in modo di fare nel modo corretto..
si so che si trova nei manuali etc ma ciò che mi serviva capire è come varia questa distanza dei cicli cambinado tipo di diluizione..ovvero con diluizioni di un fattore di 5 per es.
cmq grazie mille |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 31 luglio 2012 : 08:22:57
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Citazione:
la citazione è un problema che cn il mio pc ma farò in modo di fare nel modo corretto..
Basta usare il tag quote. Una spiegazione completa dei tags la trovi qui
Citazione:
ciò che mi serviva capire è come varia questa distanza dei cicli cambinado tipo di diluizione..ovvero con diluizioni di un fattore di 5 per es.
2^n = fattore di diluizione
Per un fattore 5
2^n=5 n~=2.3219 |
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283
Nuovo Arrivato
115 Messaggi |
Inserito il - 01 agosto 2012 : 11:10:44
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Citazione:
2^n = fattore di diluizione
Per un fattore 5
2^n=5 n~=2.3219
grazie mille per la risposta. pongo un'altra domanda: si potresti dire come si fa di solito una prova per valutare la concentrazione dei primers? |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 02 agosto 2012 : 08:38:18
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Citazione:
si potresti dire come si fa di solito una prova per valutare la concentrazione dei primers?
Non l'ho mai fatto in vita mia, ma direi che semplicemente fai delle diluizioni dei tuoi primers e vedi quella più bassa che funziona... |
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Discussione |
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efficienza oltre il top in real time
Didattica
