avrei bisogno di sapere se ho capito bene in cosa consiste. scrivo ciò che ho capito...mi potreste aiutare??? La mappatura fisica ad alta risoluzione si può costruire mediante la tecnica del contiguo di cloni o cromosoma walking. Questa tecnica darà dei risultati ottimali se si parte da una libreria di Dna genomico costruita mediante una digestione parziale in modo che i frammenti ottenuti siano dei frammenti + o meno lunghi, overlappanti e quindi capaci di coprire ogni regione dell’intero genoma di partenza. Una volta ottenuti questi frammenti mediante digestione enzimatica con opportuni enzimi, la libreria si costruisce mediante l’utilizzo di vettori come quelli a + ampia capienza (i bac o gli yac, vettori artifciali). Questi vettori infatti possono contenere frammenti anche molto grandi.
La tecnica del cromosoma walking si basa sull’utilizzo di uno di questi BAC della libreria. Questo bac viene sequenziato e si utilizzano le sue estremità BAC ENDS per costruire degli opportuni primers. Si procede con una reazione di PCR che amplificherà non solo le sequenze BAC ends ma anche la porzione terminale dell’inserto inserito nel vettore considerato. I prodotti di questa PCR possono essere usati come sonde per lo screening della libreria genomica. Verranno identificati altri BACs e la sonda si appaierà nella regione complementare di essi. Sarà compresa anche la regione + distale rispetto alle estremità bacs. Questa regione distale può essere successivamente sequenziata e amplificata per la costruzione di nuove sonde che possono continuare l’analisi di screening e quindi a poco a poco si identificheranno porzioni sempre + distanti rispetto a quella di partenza! Stiamo quindi camminando sul cromosoma!
Camminare sul cromosoma quindi significa costruire un contiguo di geni partendo la sequenze che si overlappano tra loro . ovviamente bisogna andare alla ricerca di sequenze che si overlappano per la minor porzione possibile: tale fenomeno si chiama minimal timing path cioè è la collezione di frammenti genomici in grado di coprire una grande porzione di DNA attraverso sequenze che si overlappano per la minore regione possibile.
In alternativa al cromosoma walking si può utilizzare un’altra tecnica : quella shot gun che consta in un sequenziamento e frammentazione di un bac di partenza e dell’inserto presente in esso. Si ottengono così piccoli frammenti che vengono posti all’interno di vettori plasmi dici di cui le estremità sono note. In questo modo l’assemblaggio, conoscendo le estremità, è molto + veloce e avviene mediante l’utilizzo di algoritmi. Questo metodo non necessita di una mappa fisica ma è una tecnica in cui si possono commettere molti errori nel congiungimento della sequenza dei frammenti.