mappa fisica : cromosoma walking

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Lisa.ody
Nuovo Arrivato

43 Messaggi

Inserito il - 13 luglio 2009 : 17:12:50

avrei bisogno di sapere se ho capito bene in cosa consiste. scrivo ci� che ho capito...mi potreste aiutare???
La mappatura fisica ad alta risoluzione si pu� costruire mediante la tecnica del contiguo di cloni o cromosoma walking.
Questa tecnica dar� dei risultati ottimali se si parte da una libreria di Dna genomico costruita mediante una digestione parziale in modo che i frammenti ottenuti siano dei frammenti + o meno lunghi, overlappanti e quindi capaci di coprire ogni regione dell�intero genoma di partenza.
Una volta ottenuti questi frammenti mediante digestione enzimatica con opportuni enzimi, la libreria si costruisce mediante l�utilizzo di vettori come quelli a + ampia capienza (i bac o gli yac, vettori artifciali). Questi vettori infatti possono contenere frammenti anche molto grandi.

La tecnica del cromosoma walking si basa sull�utilizzo di uno di questi BAC della libreria.
Questo bac viene sequenziato e si utilizzano le sue estremit� BAC ENDS per costruire degli opportuni primers. Si procede con una reazione di PCR che amplificher� non solo le sequenze BAC ends ma anche la porzione terminale dell�inserto inserito nel vettore considerato.
I prodotti di questa PCR possono essere usati come sonde per lo screening della libreria genomica.
Verranno identificati altri BACs e la sonda si appaier� nella regione complementare di essi. Sar� compresa anche la regione + distale rispetto alle estremit� bacs. Questa regione distale pu� essere successivamente sequenziata e amplificata per la costruzione di nuove sonde che possono continuare l�analisi di screening e quindi a poco a poco si identificheranno porzioni sempre + distanti rispetto a quella di partenza! Stiamo quindi camminando sul cromosoma!

Camminare sul cromosoma quindi significa costruire un contiguo di geni partendo la sequenze che si overlappano tra loro . ovviamente bisogna andare alla ricerca di sequenze che si overlappano per la minor porzione possibile: tale fenomeno si chiama minimal timing path cio� � la collezione di frammenti genomici in grado di coprire una grande porzione di DNA attraverso sequenze che si overlappano per la minore regione possibile.

In alternativa al cromosoma walking si pu� utilizzare un�altra tecnica : quella shot gun che consta in un sequenziamento e frammentazione di un bac di partenza e dell�inserto presente in esso.
Si ottengono cos� piccoli frammenti che vengono posti all�interno di vettori plasmi dici di cui le estremit� sono note. In questo modo l�assemblaggio, conoscendo le estremit�, � molto + veloce e avviene mediante l�utilizzo di algoritmi. Questo metodo non necessita di una mappa fisica ma � una tecnica in cui si possono commettere molti errori nel congiungimento della sequenza dei frammenti.

help me!!!! :(

mikymiky
Nuovo Arrivato

Prov.: Brescia
Citt�: lonato

45 Messaggi

Inserito il - 13 luglio 2009 : 19:12:25

a me par che vada tutto bbbbene!!