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elenina
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
 Inserito il - 25 luglio 2009 : 12:15:07
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ciao a tutti!!!sono disperata perchè ho tantissimi dubbi inerenti il metodo high resolution:io credo di aver capito che la real può essere usata anche per analisi di mutazioni, e quindi qualitative, ma che è meglio usare la high resolution x i tempi ed i costi minori.quindi credo ch il metodo della real per analisi di mutazioni sia stata superata dalla high resolution melting...ma in alcuni articoli sono scritte cose che con ciò contrastano e mi hanno fatto sorgere i seguenti dubbi:
1-per eseguire un'analisi sulle mutazioni con il metodo high resolution si utilizza la real time PCR o la rapid cycle PCR?
2-la real time è già di per sè un metodo high resolution melting ma ci sono strumenti moderni di high resolution melting che non prevedono l'uso della real time?
3-perchè si usa la real time per un'analisi qualitativa (cioè analisi di mutazioni) visto che è una PCR quantitativa?e quindi si può usare la real time per analisi di mutazioni?
Grazie davvero a tutti!!!!
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 25 luglio 2009 : 15:43:02
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Dicamo che sono due metodi un po' diversi.
Con la real-time puoi fare l'analisi di mutazioni ad es. utilizzando delle sonde diverse che riconoscono WT o mutato.
La HRM (high resolution melting) si basa sull'utilizzo della "curva di melting".
Ora la curva di melting la puoi avere anche in una real-time normale, è un passaggio che si fa dopo la PCR nel caso non si utilizzino sonde ma fluorofori che legano il DNA, come ad es. il SYBR Green. Questa però in genere non è ad alta risoluzione, quindi diventa difficile distingure tra WT e mutato con la curva di melting.
Per fare questo esistono macchinari di PCR real-time che hanno anche l'HRM, quindi dopo la PCR real-time fanno una curva di melting che è ad alta risoluzione. Oppure puoi avere strumenti che fanno solo HMR (senza PCR), in questo caso tu puoi fare una PCR con un Thermal Cycler qualsiasi e poi utilizzare l'amplificato (ovviamente devi avere anche il fluoroforo nella PCR) per fare l'analisi con lo strumento per HRM.
Questo giusto per dire 2 cose in linea generale.
Aggiungo solo che in genere non si utilizza SYBR Green, ma vengono preferiti altri fluorofori (diversi a secondo della casa che te lo vende).
Per vedere le cose in maggiore dettaglio puoi dare un occhio a discussioni precedenti, come ad es. questa: http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=4526
e guardarti questa presentazione relativa ad uno strumento per fare HMR: http://www.labogen-srl.it/catal/idaho_ita.ppt
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elenina
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
Inserito il - 27 luglio 2009 : 10:45:25
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grazie mille della tua risposta.
ciò che mi hai scritto è una conferma delle mie supposizioni, ma avrei un ulteriore dubbio:
posso considerare le real time PCR come un metodo alternaivo, sebbene suparato, per scovare nuove mutazioni oppure la sua precisione in merito è talmente bassa da non poter essere considerato tale?
Sei una grande ti ringrazio già per il tuo sicuro aiuto!!!!
Ciao |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 27 luglio 2009 : 19:04:58
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Citazione:
Messaggio inserito da elenina
posso considerare le real time PCR come un metodo alternaivo, sebbene suparato, per scovare nuove mutazioni oppure la sua precisione in merito è talmente bassa da non poter essere considerato tale?
 mmm più che altro la real-time non la vedo adatta come tecnica per individuare nuove mutazioni!
(poi magari esiste una marea di letteratura che dice il contrario, ma io non la vedo adeguata come tecnica) |
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real time PCR vs high resolution melting
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