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vesania
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Città: rovigo-ferrara-rovigo
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 Inserito il - 13 agosto 2009 : 11:09:43
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sbirciando nella sezione protocolli ho trovato questo protocollo di precipitazione dei prodotti di pcr http://www.molecularlab.it/protocolli/protocol.asp?id=23
Questo protocollo potrebbe favorire una resa maggiore, ossia una visualizzazione piu' nitida durante il controllo della digestione con corsa elettroforetica?
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gilthanas
Nuovo Arrivato
100 Messaggi |
Inserito il - 19 agosto 2009 : 23:42:47
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direi proprio di no...non mi sembra una grande idea...
tanto per carire meglio...
il frammento di PCR che ottieni è molto abbondante???
in quanto fai la reazione di PCR 50, 25 o 15 ul??
io ti dico...ne ho fatto un be pò di quel tipo di RFLP...
in genere usavo 10ul di PCR (non purificata, non è così necessario)
facevo la digestione in un volume finale di 20ul
buffer e BSA se necesario
e un bel pò di enzima...tipo 5-10 unità..poi digestione 3h a 37°C
dovresti andare sul sicuro...
allora: quante volte taglia il tuo enzima nel frammento di PCR?
più volte taglia e meno abbondanti saranno i frammenti che otterrai...soprattutti quelli più piccoli...
la cosa milgiore da fare è partire con più materiale da digerire e aumentare l'apporto di enzima di conseguenza... (per es. fare la PCR in 50ul ed usarne 20 per la digestione portando il volume finale a 30-40ul al max)..
tutto qui... |
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vesania
Nuovo Arrivato
Città: rovigo-ferrara-rovigo
98 Messaggi |
Inserito il - 20 agosto 2009 : 11:25:52
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| Infatti già faccio così, la pcr è effettuata in un volume finale di 50 ul, e la digestione è condotta con 25 ul di prodotto di pcr e 5 ul di mx di digestione. l'enzima taglia solo una volta |
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gilthanas
Nuovo Arrivato
100 Messaggi |
Inserito il - 25 agosto 2009 : 00:56:41
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...E quanto abbondante è il frammento di PCR?? Ha una buona resa o no??
Quanto carichi su gel dei 50ul di PCR x controllarla prima della digestione?? Io ti consiglierei di caricarne 5ul e renderti conto da qui dell'efficiency della PCR...
io lavorei su questo step...
come dicevi tu, l'enzima taglia solo 1 volta, quindi dovrebbe generare due frammenti od uno solo a seconda del polimorfismo...quindi l'abbondanza del tuo prodotto di PCR sarà dimezzata (o giù di lì) in un caso...
cercherei di massimizare la processività della PCR... |
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precipitazione o non precipitazione?
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