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morgana609
Nuovo Arrivato
9 Messaggi |
 Inserito il - 15 settembre 2009 : 23:04:28
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ciao,vorrei capire bene come si può effettuare una pcr inserzione..vorrei inserire la sequenza GCATGA dove c'è asterisco...ma ho dubbi...
io procedo facendo un primer all'estremità 5' e un altro in direzione 3'-5' per capirci sotto all'asterisco...e questo sarebbe il mio primo ciclo pcr identificandolo pcr 1-3
poi
secondo ciclo definito 1-4 progettando primer all'estremità 5' e 3'...
poi altro ciclo di pcr 1-4 su miscela degli ampliconi 1-3 e 2-4
grazie alla DNApol ci sarà allungamento sequenze e quindi otterò il mio prodotto...ma quando vado ad inserire nella progettazione del primer la mia sequenza GCATGA??
Immagine:
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 16 settembre 2009 : 15:18:45
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Lo schema è questo:
Tu devi disegnare i primer in questo modo:
- prima PCR:
* forward normale (sequenza a partire dal 5')
* reverse con inserzione(sequenza prima dell'inserzione + inserzione)
- seconda PCR:
* forward con inserzione (inserzione + sequenza dopo l'inserzione )
* reverse normale (sequenza a partire dal 3')
Poi metti assieme i 2 amplificati e fai una PCR con i primers esterni:
* forward normale prima PCR: (sequenza a partire dal 5')
* reverse normale seconda PCR: (sequenza a partire dal 3') |
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morgana609
Nuovo Arrivato
9 Messaggi |
Inserito il - 16 settembre 2009 : 15:40:34
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quindi se ho capito bene prova a guardare le freccie che ho aggiunto io farei:
PCR 1-3: IL PRIMO PRIMER IN 5' MENTRE IL PRIMER REVERSE CONTERò LE AT(PER ES)AGGIUNTE?
PCR 2-4: PRIMER VICINO ALL'AGGIUNTA CONTANDO LE AGGIUNTE E L'ALTRO REVERSE SEMPLICE.
PCR SU MICSELA DEGLI AMPLICONI
Allegato:  inserzione.doc
128,42 KB
SCUSA IL DISEGNO..MA è PER CAPIRCI:::) |
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morgana609
Nuovo Arrivato
9 Messaggi |
Inserito il - 16 settembre 2009 : 16:24:19
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scusa cara gf pina..ma il ragionamento per pcr DELEZIONE..è IL MEDESIMO BASTA CHE IO TAGLI LA SEQUENZA CHE NON VOGLIO QUANDO PROGETTO I MIEI PRIMER POI SEGUO SEMPRE GLI STESSI STEP...
CREDO DI AVER CAPITO..POI I PRODOTTI LI METTO IN ELETTROFORESI E DOPO?POSSO CLONARE GIUSTO?
GRAZIE GF PINA!! |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 16 settembre 2009 : 16:58:45
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Allora non so se si è spostato qualcosa nel documento che hai allegato, ma i primers messi così sono sbagliati! Il tuo 2 sta prima del 3 e così non funzionerebbe, ho rifatto il disegno, in verde sono indicate le inserzioni:
Si per la delezione il concetto è simile.
Citazione:
POI I PRODOTTI LI METTO IN ELETTROFORESI E DOPO?POSSO CLONARE GIUSTO?
beh i prodotti si puoi separarli mediante elettroforesi ed excisione della banda dal gel.
Poi se il tuo scopo finale è clonare, si li cloni! |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
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morgana609
Nuovo Arrivato
9 Messaggi |
Inserito il - 16 settembre 2009 : 17:43:48
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| GRAZIE!! |
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