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kasta86
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Città: milano
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 Inserito il - 18 settembre 2009 : 17:35:47
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Salve a tutti. Sono uno studente di biotech mediche che sta effettuando il tirocinio di tesi!
Sto or ora affrontando un problema di ben difficile soluzione. Sto cercando effettuare un WB ibridando con sieri di pazienti un lisato cellulare. Il problema è che i sieri sporcano troppo la nitro e l'immagine dopo gia 1 sec di esposizione in ECL risulta troppo scura per essere valutata. Premesso che ho gia cercato di ottimizzare in ogni modi (riducendo il tempo di ibridizione, aumentando i lavaggi, usando il triton come detergente invece del tween 20 etc etc) vorrei avere una vostra opinione per migliorare l'immagine! Grazie mille!!!!!
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 18 settembre 2009 : 17:51:26
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Premetto che non mai fatto un WB con siero, però credo che in questo caso la cosa fondamentale sia bloccare bene la membrana in modo che ci siano meno legami aspecifici. Cosa utilizzi come blocco? Potresti fare delle prove variando quello, puoi utilizzare latte, BSA oppure ci sono varie soluzioni di blocking commerciali.
Inoltre il siero lo utilizzi così o diluito? Magari diluendolo si riduce il problema, puoi anche diluirlo nella soluzione di blocco.
In casi estremi puoi aspettare un po' ad applicare la lastra dopo aver messo l'ECL, in modo che il segnale diminuisca (ovviamente diminuirà sia il fondo che il segnale specifico. Se utilizzi le lastre e non un acquisitore di immagine puoi provare a mettere 2 lastre sovrapposte, in alcuni casi funziona, sulla seconda lastra il segnale sarà visibile meglio.
Altro non mi viene in mente.
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kasta86
Nuovo Arrivato
Città: milano
15 Messaggi |
Inserito il - 18 settembre 2009 : 18:11:03
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| Prima tutto grazie mille della risposta! Sono tutti ottimi consigli....ma che purtroppo ho gia provato!!!!! Più che altro una mia collega mi ha consigliato di fare un passaggio del siero prima su una nitro vergine! Potrebbe essere secondo voi una soluzione? Si cmq i sieri li utilizzo diluiti in latte!! |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 18 settembre 2009 : 18:16:44
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| Si potrebbe essere una buona idea in effetti! Dovrebbe legarsi solo quello che cross reagisce e non gli anticorpi, in effetti credo che per i sieri si faccia prima un pre-asdorbimento prima di utilizzarli, ma dovresti guardare se trovi qualcosa in letteratura. |
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kasta86
Nuovo Arrivato
Città: milano
15 Messaggi |
Inserito il - 18 settembre 2009 : 20:46:49
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Bene! Allora lunedi riproverò cosi. Poi vi faccio sapere. Penso sia una cosa utile per tutti.
CIAO |
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kasta86
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Città: milano
15 Messaggi |
Inserito il - 24 settembre 2009 : 13:28:04
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Allora ho fatto!!! Ho provato un nuovo approccio. Sui sieri sono "salito sopra" con un Ab anti Ig human biotinilato e con un terzo step con STREPTA XOX ho ibridato la nitro. Allora l'immagine risulta infinitamente più pulita. Il rumore di fondo è completamente scoparso e le bande sono visibili!! Quindi metodica messa a punto!!!
GRAZIE
CIAO |
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RM
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115 Messaggi |
Inserito il - 24 settembre 2009 : 13:52:01
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Ciao. Ho un problema simile al tuo. Potresti illustrare più dettagliatamente il protocollo che hai usato?
Grazie |
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kasta86
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Città: milano
15 Messaggi |
Inserito il - 24 settembre 2009 : 14:08:02
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Certo no problem!!
Allora sulla nitro caricata con lisato cellulare ho ibridato i sieri (circa 100 gamma per 1h). Dopo un'ora di incubazione ho proceduto con 5 lavaggi con TBS Triton 0,5% di 5 minuti e un'ultimo lavaggio con TBS 1X sempre per 5 minuti. Dopo ho ibridato la nitro con un anticorpo anti Ig-Human biotinilato (1h a 1:400). In seguito all'incubazione ho proceduto con la serie di lavaggi sopra illustrata. Al termine di questi ho ibridato ancora la nitro con STREPTA XOX (1h per 1:1500). Ancora lavaggi e sviluppo.
P.S Sieri, secondario e STREPTA sono stati tutti rispospesi in TBS/BSA 3% Triton 0,1%. Si utilizza anche la BSA per la saturazione della nitro perchè il latte sembra possa interferire con l'ECL!
Sei ha dubbi chiedi!! E fammi sapere se ti è venuto che sono curioso!!!
ciao |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 24 settembre 2009 : 22:51:24
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Bene sono contenta che il problema si sia risolto! 
Se vuoi puoi anche mettere il protocollo nella sezione protocolli: http://www.molecularlab.it/protocolli/
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Western Blot Sieri
Didattica
