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ser
Nuovo Arrivato
97 Messaggi |
 Inserito il - 30 settembre 2009 : 19:25:45
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Salve a tutti,
Mi accingo ad usare i microsatelliti (SSR) da applicare su una specie vegetale. In particolare devo fare una certificazione genetica mediante ssr su alcuni campioni vegetali per stabilire confrontandoli con la varietà-tipo di riferimento se appartengono alla stessa varietà coltivata. E' la mia prima volta in modo autonomo. Ho già sviluppato il modo di procedere…spero vada bene…chiedo a voi conferme e suggerimenti:
1. Ricerca bibliografica.
2. Estrazione DNA dei campioni da esaminare e del genotipo- tipo. A tal proposito vorrei evitare di utilizzare i kit ma utilizzare dei protocolli presenti in bibliografia. Verifica su gel del DNA estratto e uso dello spettrofotometro per quantificare.
3. Ricerca in bibliografia dei primers più indicati da utilizzare per quella specie vegetale.
4. PCR ed elaborazione dei dati.
Se volessi disegnare i primers…dovrei inizialmente sequenziare il DNA-Tipo, ricercare le sequenze ripetute e utilizzare il programma Primer 3 (copia e incolla dei tratti contenenti le sequenze ripetute) per elaborare i primers FW e Rev migliori. A questo punto dovrò ordinare i primers così disegnati. Un dubbio: quanto deve essere lungo il tratto sequenziato che conterrà il micro satellite da inserire nel programma Primer 3?
Seconda domanda: quante coppie di primers occorrono per fare una certificazione attendibile?
Terza domanda: come si riconoscono i primers migliori da una ricerca bibliografica? Come posso valutare il potere discriminante di un primer rispetto ad un altro ?
Infine (ma mi riservo in seguito ) quarta domanda: in una certificazione genetica occorre elaborare i dati mediante programmi statistici e bioinformatici o è sufficiente la semplice visione dei patterns per i vari primers e scrivere in una relazione se c’è o non c’è sovrapponibilità di bande (indicando ovviamente il numero di bp)?
Spero di ricevere il vostro aiuto
Grazie
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 30 settembre 2009 : 19:37:48
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Ti rispondo solo in parte, in attesa che qualcuno più esperto di me ti risponda più nello specifico:
Citazione:
Se volessi disegnare i primers…dovrei inizialmente sequenziare il DNA-Tipo, ricercare le sequenze ripetute e utilizzare il programma Primer 3 (copia e incolla dei tratti contenenti le sequenze ripetute) per elaborare i primers FW e Rev migliori. A questo punto dovrò ordinare i primers così disegnati. Un dubbio: quanto deve essere lungo il tratto sequenziato che conterrà il micro satellite da inserire nel programma Primer 3?
Intanto ti consiglio in alternativa a Primer3 l'utilizzo di Primer BLAST, che ti fa anche un BLAST sulla sequenza che non guasta mai, lo trovi qui: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi
Il tratto da inserire può essere lungo quanto vuoi, dipende da cosa vuoi identificare. Siccome è solo una PCR analitica poco importa la dimensione dell'amplificato.
Citazione:
A tal proposito vorrei evitare di utilizzare i kit ma utilizzare dei protocolli presenti in bibliografia. Verifica su gel del DNA estratto e uso dello spettrofotometro per quantificare.
E perchè mai? Se c'è un kit bello e pronto usalo! Ti risparmierai tutta la noiosa parte di ottimizzazione della PCR.
Citazione:
Terza domanda: come si riconoscono i primers migliori da una ricerca bibliografica? Come posso valutare il potere discriminante di un primer rispetto ad un altro ?
Beh, procurati dei campioni sicuramente positivi e/o negativi e prova i diversi primers su quelli.
Citazione:
in una certificazione genetica occorre elaborare i dati mediante programmi statistici e bioinformatici o è sufficiente la semplice visione dei patterns per i vari primers e scrivere in una relazione se c’è o non c’è sovrapponibilità di bande (indicando ovviamente il numero di bp
Beh, credo che nel tuo caso la banda/le bande o ci sono o non ci sono, quindi direi che basta dire quello. Tuttavia non ci metterei la mano sul fuoco, lascio la parola a qualcuno più esperto. |
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ser
Nuovo Arrivato
97 Messaggi |
Inserito il - 01 ottobre 2009 : 14:54:49
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Intanto ti consiglio in alternativa a Primer3 l'utilizzo di Primer BLAST, che ti fa anche un BLAST sulla sequenza che non guasta mai, lo trovi qui: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi
Il tratto da inserire può essere lungo quanto vuoi, dipende da cosa vuoi identificare. Siccome è solo una PCR analitica poco importa la dimensione dell'amplificato.
Ottimo consiglio, grazie ma devo modificare dei parametri o faccio semplicemente copia e incolla dei tratti di sequenza che mi interessano?E poi un'altra domanda: il tratto da immettere nel Blast deve necessariamente contenere al suo interno le sequenze ripetute!Confermi?
E perchè mai? Se c'è un kit bello e pronto usalo! Ti risparmierai tutta la noiosa parte di ottimizzazione della PCR.
Che costo può avere il kit? Quali case produttrici mi consigli?
Ciao e grazie per la risposta tempestiva....comunque mi sembra di capire che il mio modo di procedere sia giusto! |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 01 ottobre 2009 : 18:38:24
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Citazione:
Ottimo consiglio, grazie ma devo modificare dei parametri o faccio semplicemente copia e incolla dei tratti di sequenza che mi interessano?E poi un'altra domanda: il tratto da immettere nel Blast deve necessariamente contenere al suo interno le sequenze ripetute!Confermi?
Devi inserire una zona di DNA contenente la regione che vuoi amplificare! In realtà se hai la refseq puoi inserire quella e funziona anche meglio
Non so se i parametri standard vadano bene in caso di microsatelliti, sorry.
Citazione:
Che costo può avere il kit? Quali case produttrici mi consigli?
Mai usati personalmente.
Da una veloce ricerca ho visto che li puoi prendere da Qiagen (costo ~$1/reazione)
http://www1.qiagen.com/Products/Type-itMicrosatellitePCRKit.aspx
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ser
Nuovo Arrivato
97 Messaggi |
Inserito il - 01 ottobre 2009 : 19:07:56
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| Cosa sono i refseq ? |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 01 ottobre 2009 : 20:37:48
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RefSeq è un database di sequenze (DNA, RNA e proteine) gestito da NCBI.
La differenza con GenBank (sempre NCBI) è che non è ridondante (cioè le sequenze non sono ripetute)
Quando cerchi su NCBI nucleotide riconosci le entry refSeq dal fatto che iniziano con due lettere, seguite da _ e poi da un numero
Ad es:
NC_123456
Le due lettere significano:
NC: sequenza genomica completa
NG: sequenza genomica incompleta
NM: mRNA
NR: RNA non codificante
NP: proteina
Inoltre sotto le entry di RefSeq trovi scritto "ref" ad es:
NG_011535
Homo sapiens estrogen receptor 2 (ER beta) (ESR2) on chromosome 14
gi|224809423|ref|NG_011535.1|[224809423]
In questo caso in primerBlast puoi inserire sia "224809423" sia "NG_011535" invece della tua sequenza
Più info qui:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/
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