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tambua
Nuovo Arrivato
50 Messaggi |
 Inserito il - 21 ottobre 2009 : 12:33:38
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Piccola domanda per cultori dell'argomento:
L'impiego dell'RNA interference ai fini di un silenziamento genico mirato,prevede l'impiego direttamente dei siRNA (quindi RNA double strand non più lunghi di 21-23 bp), oppure è anche possibile usare RNA molto più lunghi e sfruttare il complesso Dicer cellulare per generare i siRNA?
Onestamente ho questa domanda ed anche leggendo svariati argomenti a riguardo non è che ci abbia capito molto? Penso comunque che convenga utilizzare direttamente i siRNA, perchè RNA oltre una certa lunghezza dovrebbero stimolare la risposta interferonica.
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 21 ottobre 2009 : 14:55:25
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Citazione:
Messaggio inserito da tambua
L'impiego dell'RNA interference ai fini di un silenziamento genico mirato,prevede l'impiego direttamente dei siRNA (quindi RNA double strand non più lunghi di 21-23 bp), oppure è anche possibile usare RNA molto più lunghi e sfruttare il complesso Dicer cellulare per generare i siRNA?
Certo che si fa! È uno dei metodi utilizzati per fare silenziamento genico, anziché utilizzare siRNA di 21-31-mer si utilizzano siRNA di circa 25-30-mer che sono subrstrati di Dicer.
È stato visto che questi sono molto più efficienti in quanto vengono introdotti nel meccanismo uno step prima rispetto ai classici siRNA sintetici da 21-23-mer, arrivano direttamente a Dicer che li taglia nella maniera "corretta", questo è il motivo fondamentale per cui funzionano meglio rispetto a quelli corti che bypassano Dicer.
Comunque se vuoi ulteriori informazioni guarda questi link:
Optimizing knockdown of gene expression using the TriFECTa Dicer-substrate RNAi reagent system
TriFECTa RNAi User Guide (pdf)
Dicer-Substrate siRNA Technology (Bio-Rad)
Total Solutions to Gene Silencing (Tema) - in Italiano
N.B. la strategia è stata sviluppata da IDT (Integrated DNA Technologies), poi varie ditte li rivendono ma comunque il marchio è IDT.
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 21 ottobre 2009 : 15:02:44
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Un'altra cosa molto importante è il fatto che i dsRNA lunghi
sono molto più 'proficient' nell'innescare una risposta interferonica
nelle cellule degli Eucarioti Metazoi, che vedono il dsRNA come
un intermedio di replicazione virale (e lo riconoscono tramite
pattern recognition receptors, trasduttori di segnale endogeni).
Per questo motivo si possono utilizzare lunghi dsRNA solamente
in organismi come C. Elegans, Drosophila e i protozoi non gemmanti
(perchè quelli gemmanti, tipo S. Cervisiae, NON hanno l'RNAi).
Nelle specie superiori, invece, il rischio è quello di innescare
una risposta innescata dall'interferone e mediata da PKR, che porta
al cosiddetto "shut off", cioè la repressione generalizzata della
traduzione degli mRNA (un meccanismo di difesa antivirale): rischi
cioè di ottenere un silenziamento non specifico, bensì artificioso.
Per risolvere questo problema, molto vero nelle cellule di Mammifero,
si è pensato di passare direttamente allo step a valle: i siRNA sono
sufficientemente piccoli non da innescare uno shut-off, però è anche
vero che in certi lavori è stata appurata la loro capacità di innescare
una piccola risposta intereferonica, potenzialmente confondente
(specialmente se i siRNA vengono espressi in situ come shRNA).
L'unico modo per fare RNAi senza turbare gli equilibri cellulari è
quello di imitare il meccanismo naturale endogeno, cioè usare i miRNA.
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Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 21 ottobre 2009 : 15:43:43
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Citazione:
Messaggio inserito da Dionysos
Un'altra cosa molto importante è il fatto che i dsRNA lunghi
sono molto più 'proficient' nell'innescare una risposta interferonica
nelle cellule degli Eucarioti Metazoi, che vedono il dsRNA come
un intermedio di replicazione virale (e lo riconoscono tramite
pattern recognition receptors, trasduttori di segnale endogeni).
Si concordo, ma attenzione ad una cosa però:
i 27-meri sono diversi dai lunghi dsRNA (in genere > 30nt) ed è stato visto che non inducono la risposta interferonica al pari dei lunghi dsRNA (o quando meno la inducono in maniera molto ridotta), per dirla in parole semplici: sono una sorta di via di mezzo che ovvia ai problemi dei dsRNA lunghi (ridotta attivazione della risposta interferonica) ma che sono più efficienti dei "corti" siRNA (perché passano da Dicer).
Questo per sottolineare i vantaggi di queste molecole e il motivo per cui vengono utilizzate (tuttora!), non certo per fare pubblicità, ma per rispondere alla domanda di tambua.
Poi caro Dionysos...
Citazione:
L'unico modo per fare RNAi senza turbare gli equilibri cellulari è
quello di imitare il meccanismo naturale endogeno, cioè usare i miRNA.
certo che se mi tiri in ballo i miRNA... sai che non posso far altro che concordare con te!  |
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tambua
Nuovo Arrivato
50 Messaggi |
 Inserito il - 21 ottobre 2009 : 16:47:59
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Figliuoli, troppa grazia, davvero.
Non so come ringraziarvi!!! GRAZIE!! |
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tambua
Nuovo Arrivato
50 Messaggi |
Inserito il - 24 ottobre 2009 : 19:19:57
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A questo punto mi rivolgo agli stessi che hanno avuto la gentilezza di spiegarmi l'RNA interference.
Ragazzi qualcuno di voi ha esperienza di siRNA libraries? Sareste così gentili da spiegarmi in cosa consistono? |
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Gst
Utente Junior
Prov.: Roma
Città: Ariccia
143 Messaggi |
Inserito il - 25 ottobre 2009 : 13:36:00
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 i microRNA?! E come si possono usare? ce ne sono di commerciali... come gli siRNA? Possono essere ordinati per la proteina di proprio interesse? |
Ascoltami con gli occhi... |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 25 ottobre 2009 : 16:00:23
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Citazione:
Messaggio inserito da tambua
Ragazzi qualcuno di voi ha esperienza di siRNA libraries? Sareste così gentili da spiegarmi in cosa consistono?
Beh sono librerie di siRNA per l'appunto, poi ogni ditta ha le sue col suo metodo (21-meri, 27-meri ecc.....)
comunque per farla breve tu dici alla ditta che vuoi silenziare il gene X e loro ti mandano dei siRNA specifici per quel gene, in genere sono formati da 3 siRNA per ogni gene.
Citazione:
Messaggio inserito da Gst
i microRNA?! E come si possono usare? ce ne sono di commerciali... come gli siRNA? Possono essere ordinati per la proteina di proprio interesse?
Beh i miRNA sono un po' diversi dai siRNA, innanzitutto devi tener presente che un singolo miRNA può avere più target, quindi silenziare geni diversi. Poi i miRNA non sono esattamente complementari alla sequenza dell'mRNA come è invece il siRNA e questo complica un po' la questione, esistono vari programmi per predire quali possono essere i target di un certo miRNA oppure viceversa conoscendo un mRNA si può andare a vedere quali miRNA potenzialmente lo legano, ma poi questo deve essere validato e non sono moltissimi ancora i target validati per i vari miRNA (per fortuna così noi abbiamo qualcosa da studiare!  )
Comunque quello che si può fare è overesprimere un certo miRNA e andare a vedere gli effetti sul silenziamento di un certo mRNA. Oppure viceversa silenziare un miRNA e quindi attivare il suo (suoi) mRNA target.
Poi lascio la parola anche a Dionysos!  |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 25 ottobre 2009 : 17:21:34
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Esistono gli amiR (artificial miRNA) disegnabili custom! Non so quanto valgano però
googlare per credere |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
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tambua
Nuovo Arrivato
50 Messaggi |
Inserito il - 26 ottobre 2009 : 10:27:04
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tambua
Nuovo Arrivato
50 Messaggi |
Inserito il - 26 ottobre 2009 : 17:34:02
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Ci capisce nessuno niente?
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Per chi se ne intende di RNA interference
Didattica
