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pesciolino
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 30 novembre 2009 : 10:33:35
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ciao a tutti....ho un pò di problemi con quet'articolo ....esso tratta dell'espressione della miostatina.Dopo aver eseguito la rt pcr si procede con il southern blot. l'ibridazione avviene in presenza di una sonda marcata con digoxigenina sintetizzata attraverso la pcr utilzzando gli stessi primers dell'rt pcr ed un plasmide contenente la completa miostatina cdna come stampo.potreste spiegarmi questo concetto???? la sonda come viene sintetizzata attraverso la pcr e perchè si utiliza il plasmide???? grazie a tutti.
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Dionysos
Moderatore
  

Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 30 novembre 2009 : 13:18:12
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Attento, se studi espressione genica tramite RT-PCR quello che farai sarà un Northern blot (non un southern)
Il plasmide col cDNA si usa come stampo per sintetizzare una sonda che sia esattamente complementare al trascritto maturo (spliceato) del gene in questione.
Secondo me "con gli stessi primers della RT-PCR" significa semplicemente che si utilizzano nonameri/esameri random. Ti risulta? |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà (F.W. Nietzsche)
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GFPina
Moderatore
    

Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 30 novembre 2009 : 13:53:30
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No è un Southern, perchè quello che blotti sulla membrana è di fatto DNA (amplificato dalla PCR) non l'RNA di partenza. Anche se è vero che il tutto ti serve per analizzare l'RNA.
"gli stessi primers della RT-PCR" sono i primers che usi per la PCR dopo la retrotrascizione, quindi non random examers ma i primer specifici per il tuo templato. Per come si fa la sonda prova a guardare ad es. questo, è la spiegazione di un kit: PCR DIG Probe Synthesis Kit From Roche poi bisogna vedere nell'articolo esattamente cosa abbiano fatto, ma il senso è quello.
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Dionysos
Moderatore
  

Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 30 novembre 2009 : 17:16:02
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Ops è vero |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà (F.W. Nietzsche)
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pesciolino
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 01 dicembre 2009 : 09:01:25
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è necessariamente un southern  quello che non capisco è perchè si utilizza un vettore di clonaggio come stampo???? è necessario???
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Patrizio
Moderatore
  

Città: Barcellona
1915 Messaggi |
Inserito il - 01 dicembre 2009 : 10:21:25
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il cDNA da stampo all interno del plasmide ti serve unicamente per sintetizzare la sonda,non per il resto del southern |

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pesciolino
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 01 dicembre 2009 : 10:57:34
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grazie grazie grazie! avrei erò un'altra domanda...non ho capito perchè dopo la RT PCR si esegue la rapid amplification of cdna ends (5'RACE). perchè viene sviluppata e come funziona questa tecnica? |
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