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Autore Discussione  

makia
Nuovo Arrivato



11 Messaggi
Inserito il - 08 gennaio 2010 : 13:42:18  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di makia Invia a makia un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
mi aiutare a capire brevemente come nella pratica si devono utilizzare gli er in seguito alla pcr..?cioe nn capisco come devono essere aggiuti quale è la procedura che soliamente si segue?non esiste un protocollo come nella pcr?

darkene
Utente Junior

occhi



291 Messaggi
Inserito il - 08 gennaio 2010 : 15:34:36  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di darkene Invia a darkene un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
una volta ottenuto l'amplificato di PCR, questo viene precipitato per eliminare il buffer di PCR e la Taq. a quel punto lo risospendi in acqua o TE e fai la reazione di restrizione aggiungendo il buffer di restrizione e l'enzima!
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makia
Nuovo Arrivato



11 Messaggi
Inserito il - 08 gennaio 2010 : 15:39:16  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di makia Invia a makia un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
grazieeee!!!!!!!!!!!!!
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makia
Nuovo Arrivato



11 Messaggi
Inserito il - 08 gennaio 2010 : 16:43:00  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di makia Invia a makia un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
scusate ma ci deve essere un rapporto tra il quantitativo di buffer,acqua, Enzima e dna?o no?
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mak_steon
Utente Junior



138 Messaggi
Inserito il - 08 gennaio 2010 : 16:58:59  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di mak_steon Invia a mak_steon un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Io faccio così:
Se la banda dell'amplificato si vede bene (utilizzando i parametri che usi normalmente), digerisco 5 uL di amplicone (di solito non purifico) con 1 uL di tampone (che di solito è 10X), 0.4 uL di enzima (è anche troppo, anche se non mi ricordo di preciso a quante Unità corrisponde) e porto a 10 uL con acqua.
Se la banda dell'amplificato non si vede tanto bene aumento la quantità di amplicone e diminuisco l'acqua o faccio una reazione da 15 uL invece che da 10 (ovviamente mantenendo le stesse proporzioni).
Poi lo metto a 37°C per tutta la notte (ma bastano un paio di ore)
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