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d.goldy
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39 Messaggi |
 Inserito il - 15 gennaio 2010 : 13:33:00
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Ciao a tutti,
Ho bisogno del vostro aiuto!!!
Sto trasfettando in HEK un plasmide senza GFP o altro marker, quindi mi é stato consigliato di cotrasfettare un pasmide con gfp, ma il mio problema é che non ho un microscopio a fluorescenza per vederlo.
CHE VOI SAPPIATE ESISTE QUALCHE PLASMIDE CHE ESPRIMA UNA PROTEINA COLORATA INNOQUA, TIPO BLU O A RIGHE  NON SO QUALCOSA CHE SI POSSA VEDERE CON UN NORMALE MICROSCOPIO OTTICO.
GRAZIE A TUTTI
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ukitel
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78 Messaggi |
Inserito il - 15 gennaio 2010 : 16:09:32
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Non sono esperto ma provo ad azzardare un'idea, in attesa di conferme.
Forse può andare bene la beta-galattosidasi: è capace di idrolizzare il substrato X-Gal in galattosio e un composto di colore blu, ovviamente visibile con il microscopio ottico.
Però le cellule senescenti accumulano grosse quantità di beta-galattosidasi, e forse potrebbero darti problemi.
Se non sei costretta ad utilizzare un marker visibile al microscopio, puoi cambiare totalmente sistema e sfruttare, per esempio, il gene di resistenza alla neomicina. |
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Annacrì
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3 Messaggi |
Inserito il - 15 gennaio 2010 : 16:26:27
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Anch'io sono d'accordo su beta-gal, anche perchè non ti serve proprio il microscopio,si vede a ochio nudo. L'unica cosa stai attenta a metterloin un plasmide con un marker di selezione altrimenti la tua cellula tende a perderlo facilmente |
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d.goldy
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39 Messaggi |
Inserito il - 15 gennaio 2010 : 16:52:12
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Ciao Annacrí e Ukitel
Grazie per i vostri consigli!
Anch'io avevo pensato alla ßgal ma ho anche pensato che per far virare la proteina in blu devo aggiungere un reagente, se non sbaglio... non é nocivo?
@Annacrí scusa cosa intendi per "L'unica cosa stai attenta a metterloin un plasmide con un marker di selezione altrimenti la tua cellula tende a perderlo facilmente"?
Parlando di cellule di mammifero e di trasfezioni transienti, posso usare una resistenza ad antibiotico?????
@ Ukitel:
Sai che avevo pensato a sfruttare la resistenza a G418 per scrinare le cells non trasfettate, ma proprio su questo sito mi é stato sconsigliato di usare G418 per uccidere velocemente le cells non trasfettate (insomma fare come con i batteri!!!) perché non agisce velocemente e se la concentrazione é troppo alta é tossico per entrambe le cells.... TU |
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d.goldy
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39 Messaggi |
Inserito il - 15 gennaio 2010 : 16:53:51
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scusa non avevo finito il post.......
tu hai mai provato a usare NeoR per scrinare nel giro di 1 o 2 giorni una transfezione???
Grazie |
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RM
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115 Messaggi |
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ukitel
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78 Messaggi |
Inserito il - 17 gennaio 2010 : 11:32:23
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@d.goldy
No mi spiace, come ti ho detto, non sono esperto di questo campo.
RM e Annacrì ti sapranno essere sicuramente molto più utili di me. |
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d.goldy
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39 Messaggi |
Inserito il - 18 gennaio 2010 : 13:02:00
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Ciao a tutti ancora
Grazie a tutti quelli che hanno cercato di aiutarmi, ma forse non mi sono spiegata bene e allora ho pensato di spiegare meglio cosa sto cercando...
Mi sto chiedendo se come la GFP, che si puó trasfettare e che poi non necessita altra reazione, esistesse qualche altra proteina trasfettabile che sia colorata non agli UV o sensibile agli infrarossi, ma visibile alla luce "normale" 380 ai 750 nm.
Qualcuno di voi ha notizia dell'esistenza di un plasmide o sequenza che dia una proteina colorata???? 
Please
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trasfettare con un marker colorato
Didattica
