| Autore |
Discussione |
|
|
Marianna
Utente Junior
146 Messaggi |
 Inserito il - 09 giugno 2006 : 20:57:47
|
Ragazzi..qualkuno mi sa dare qualke notizia sul tampone RIPA? Magari anke un protocollino testato...
|
Farah |
|
|
|
|
Crick82
Utente Junior
139 Messaggi |
Inserito il - 09 giugno 2006 : 23:12:16
|
Per effettuare l'estrazione di proteine da cellule di mammifero molto utilizzato è il RIPA BUFFER + una piccola quantità di un cocktail di inibitore delle proteasi.
Il RIPA BUFFER è una soluzione tampone che viene utilizzata per l'estrazione di proteine da cellule di mammifero.
Il cocktail di inibitori delle proteasi viene aggiunto per impedire l'azione delle proteasi, l'utilizzo di questo cocktail riduce quindi di molto la degradazione delle proteine durante la procedura di estrazione.
Per quanto riguarda le ricette di queste due soluzioni ti copio quello che c'è in rete, tieni presente che il cocktail di inibitori si può preparare in laboratorio oppure si può comprare la soluzione già pronta.
RIPA buffer:
•50 mM Tris-HCl, pH 7.4 (buffer, previene denaturazionedelle proteine)
•150 mM NaCl(previene l’aggregazione proteica non specifica)
•1% NP-40 (detergente non ionico per estrarre le proteine; 10% stock solutionin H2O)
Inibitori delle proteasi:
•2 mM EDTA (chelantedel calcio, 100 mM stock solutionin H2O, pH 7.4)
•2 mM PMSF (200 mM stock solutionin isopropanolo, conservare a RT)
•5 ug/mL leupeptin(conservare -20 in aliquote, 5 mg/ml in H2O)
•5 ug/mL pepstatin(conservare -20 in aliquote, 5 mg/ml in etanolo) |
 |
|
|
Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 10 giugno 2006 : 00:40:01
|
Uhm...ricordo d'aver preparato il RIPA buffer utilizzando
deossicolato di sodio anzichè NP-40, come tensioattivo.
E' possibile? |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
|
|
|
|
Crick82
Utente Junior
139 Messaggi |
Inserito il - 10 giugno 2006 : 01:13:09
|
Si, secondo alcuni protocolli il RIPA BUFFER deve essere costituito anche dal Na-deoxycholate oltre all'NP-40 e agli altri componenti detti, secondo altri invece manca uno dei due componenti.
Il protocollo è questo:
Si aggiungono 800microL di RIPA BUFFER e 16microL di inibitori delle proteasi al pellet di cellule. Si vortexa per 2 minuti, tenendo la eppendorf in ghiaccio tra una vortexata e l'altra.
Si centrifuga per 10 minuti a 14000rpm a 4°C.
Si trasferisce il suranatante in una nuova eppendorf, mentre il pellet si butta.
Il surnatante contiene tutte le proteine cellulari.
N.B. Le quantità di RIPA BUFFER e di inibitore che vengono utilizzate sono piuttosto arbitrarie, un parametro sicuramente importante è la quantità di cellule da cui si effettua l'estrazione delle proteine (ciò è visibile dalla grandezza del pellet da cui si parte). |
|
|
|
chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
|
|
Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 10 giugno 2006 : 11:26:53
|
Quasi ce ne scordavamo!!!!  |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
|
|
|
|
Marianna
Utente Junior
146 Messaggi |
Inserito il - 01 luglio 2006 : 16:28:14
|
Ehm..ehm..sono sempre io...ki mi dice come si determina la concentrazione proteica dell'estratto dopo il trattamento con il RIPA. Ho provato con il metodo di Bradford utilizzando il reattivo Biorad ma se uso come bianco il RIPA il mio campione legge negativoi...uff.... |
Farah |
|
|
|
GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 03 luglio 2006 : 18:25:57
|
Io ho due ricette del RIPA Buffer, ma ce ne sono varie modifiche.
In entrambe ci sono sia NP-40 e Sodio desossicolato, che hanno una
funzione leggermente diversa il NP-40 è un detergente non-ionico che
serve per solubilizzare, mentre il Sodio desossicolato è un detergente
anionico serve per mantenere pH sopra 8.0, previene la formazione di
cationi divalenti ed è moderatamente denaturante.
Il buffer senza Sodio desossicolato (che nel mio libro chiama "NP-40
Lysis") è quello indicato ca Crick82 è meno denaturante.
Il Ripa buffer contiene anche due detergenti ionici: SDS e Sodio desossicolato
ed è maggiormente denaturante, si ottengono più proteine ma può rompere
alcune interazioni proteina-proteina.
n.b. il NP-40 può essere invece sostituito dal Triton X-100.
Per quanto riguarda la lettura della concentrazione io uso il metodo
DC Protein Assay della Biorad ottimizzato per micropiastre. Che utilizza il metodo di Lowry.
link
|
|
|
|
Marianna
Utente Junior
146 Messaggi |
Inserito il - 27 luglio 2006 : 08:36:17
|
| Scusate ragazzi..vi ripropongo il problema RIPA...dopo aver fatto la mia presunta estrazione...quando leggo allo spettrofotometro le assorbanze sono negative..come se nel mio campione le proteine nn ci fossero..vi è mai capitato? |
Farah |
|
|
|
chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
|
|
fraulan
Nuovo Arrivato
Prov.: Ferrara
Città: Ferrara
25 Messaggi |
Inserito il - 27 luglio 2006 : 23:48:33
|
Ciao a tutti,
forse ho capito male, ma tu hai fatto il bianco per lo spettrofotometro con il buffer di lisi? Io normalmente come bianco uso solo il Biorad diluito (1 ul proteine in 1 ml Biorad diluito 1:4). Pero` e` vero: se le proteine sono troppo poche il valore puo` essere negativo...
Ciao e in bocca al lupo |
Saluti dalla Ohio State University!! |
|
|
|
Marianna
Utente Junior
146 Messaggi |
Inserito il - 28 luglio 2006 : 20:13:17
|
Scoperto l'arcano..ho fatto la prova utilizzando al posto degli RBC (su cui solitamente lavoro) delle cellule endoteliali..la concentrazione va ke è una meraviglia..probabile ke questo tampone non sia adatto per i globuli rossi. Mah...misteri della fanta..scienza!  |
Farah |
|
|
|
check1
Nuovo Arrivato
11 Messaggi |
Inserito il - 23 ottobre 2009 : 12:00:40
|
la domanda potrà sembrare banale...
quando usare una lisi in RIPA e una in SDS?? |
|
|
|
Gst
Utente Junior
Prov.: Roma
Città: Ariccia
143 Messaggi |
Inserito il - 23 ottobre 2009 : 20:54:40
|
| Io quoto GFPina... ma anche io pongo la domanda: in base a cosa scegliete un buffer di lisi per estrarre proteine? A parte quelli che usano diversi detergenti (+ o meno aggressivi), in base a quali altri componenti discriminate se sono adatti alle vostre cellule o (forse + plausibile) alle proteine di vostro interesse? |
Ascoltami con gli occhi... |
|
|
|
Nico82
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 22 maggio 2016 : 12:40:30
|
Potresti aver aggiunto troppo lysis buffer nel processo di estrazione.
Citazione:
Messaggio inserito da chick80
Mi è capitato con del mRNA. Concentrazione troppo bassa (o spettrofotometro rotto)
|
|
|
| |
Discussione |
|
RIPA buffer
Didattica
