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elianagrassi
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
 Inserito il - 19 gennaio 2010 : 10:53:44
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Ciao a tutti avrei una domanda per chi gentilmente volesse rispondermi..
Sei in un laboratorio e hai del DNA già purificato, a doppio filamento. Come si fa a denaturarlo? Avrei bisogno di sapere nello specifico cosa si fa e cosa si usa...
Grazie mille, buona giornata
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 19 gennaio 2010 : 11:24:42
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esistono diverse metodologie per denaturare il DNA.
Se per denaturare intendi separare i due filamenti ti potrei citare un paio di modi, i primi che mi vengono in mente.
Aumentare la temperatura al di sopra dei 94-95°C per qualche minuto... ottima separazione, poi raffreddi subito in ghiaccio e lo conservi così.
(usi una macchina di PCR, oppure un bagnetto termostatato)
oppure,
utilizzare delle sostanze denaturanti come il DMSO da aggiungere alla tua soluzione, oppure formaldeide, alcuni sali anfoteri, ed altre sostanze.
oppure,
cambiare il pH a livelli molto alcalini.
Esistono altri 100 modi diversi che sicuramente potresti trovare in un qualsiasi manuale di lab, come il molecular cloning di Sambrook o simili.
La scelta del metodo migliore dipende da quello che intendi fare con questo DNA.
Generalmente la temperatura è quella preferita poiché non inquina la soluzione, è pienamente reversibile e non danneggia il tuo DNA se non esageri con la temperatura e con il tempo.
In bocca al lupo.
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elianagrassi
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 20 gennaio 2010 : 10:02:04
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non potrei usare anche un'elettroforesi su gel denaturante?
Per la PCR: io so che la sua procedura è suddivisa in 3 parti: denaturazione, annealing e terminazione.. Posso usare SOLO la denaturazione e fermarmi li senza andar oltre visto che mi interessa solo denaturare e non tutto il resto? Cioe... tecnicamente è possibile fermare il termociclatore???
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 20 gennaio 2010 : 12:40:57
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Citazione:
Messaggio inserito da elianagrassi
non potrei usare anche un'elettroforesi su gel denaturante?
ripetendo quello che ha già detto Neuroscience: "dipende da quelli che ci devi fare dopo!"
Citazione:
Messaggio inserito da elianagrassi
Per la PCR: io so che la sua procedura è suddivisa in 3 parti: denaturazione, annealing e terminazione.. Posso usare SOLO la denaturazione e fermarmi li senza andar oltre visto che mi interessa solo denaturare e non tutto il resto? Cioe... tecnicamente è possibile fermare il termociclatore???
Non devi fare una PCR solo denaturare il DNA quindi metterlo a 94-95°C, qua dipende da come è fatto il tuo termociclatore ma in genere puoi impostare anche una sola temperatura per un certo tempo.
(nessuno ti vieta di impostare una PCR e poi aprire il termociclatore dopo i primi minuti di denaturazione e togliere le tue provette, ma non mi sembra una grandissima trovata, a meno che non sia l'unica opzione, e non credo!)
Comunque come suggeriva Neuroscience puoi utilizzare un bagnetto termostatato, oppure anche un termoblocco, una piastra riscaldante con un baker con dentro acqua e ci metti le provette (non a mollo, ma in sospensione possibilmente), ecc... |
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elianagrassi
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 20 gennaio 2010 : 19:38:40
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grazie ragazzi... io ho alle spalle la teoria, ma di laboratorio ben poco!!! Quindi per quanto io possa leggere su libri "denaturare il DNA" abbassando la temperatura, alterando il ph, ... ... poi in pratica non so come si fa tecnicamente la cosa.. Io sono all'inizio, sto ancora studiando e logicam la mia ignoranza si vede... 
Con le vs. risposte ora ne so qualcosa in piu... |
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