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farmacologia
Nuovo Arrivato
100 Messaggi |
 Inserito il - 26 gennaio 2010 : 22:35:55
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Salve ho una perplessità che vorrei risolvere insiene a voi.
utilizzando i seguenti primer:
Fw (69) 5' CAT CAG TCC GCA AAG CG 3'
Rev (69) 5' TGT CCA GGC AGG GCT C 3'
Fw (84) 5' CGG ACC GAG CTG GAA GT 3'
Rev (84) 5' TGT CCA GGC AGG GCT C 3'
utilizzando i programmi che conosco:
http://www.appliedbiosystems.com/support/techtools/calc/
e
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHomeAd
trovo delle Tm diverse, oltre a quello del datasheet della ditta fornitrice.
quale sceglierete? oltre a fare le prove home made?
grazie se vorrete e potrete aiutarmi.
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"l'unica differenza tra me e un pazzo è che io non sono pazzo!"
Salvador.Dalì
"L'unica differenza tra me e un pazzo è che io devo mentire la mia normalità per sopravvivere a questo falso mondo"
Farmacologia |
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legolas
Utente
Prov.: Lecce
Città: Trepuzzi
723 Messaggi |
Inserito il - 27 gennaio 2010 : 09:40:25
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Le temperature m si possono calcolare e c'è una formula precisa.
2 X AT + 4 X GC (-5°C).
I primer non devono possedere sequenze autocomplementari. |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 27 gennaio 2010 : 09:46:28
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La Tm può essere calcolata solo sperimentalmente,
le previsioni fatte con calcoli, purtroppo, possono essere vicine a quella reale oppure no, quindi esistono diversi algoritmi per tenere in considerazione i diversi parametri, come la concentrazione di sali, dei primers, pH, %GC, della sequenza, etc...
molto spesso i risultati sono molto simili con i diversi protocolli (<2°C), talvolta però sono estremamente diversi (>10°C).
Quale di queste formule ha sempre ragione, non saprei, fino ad ora non l'ho mai trovata... a volte ha ragione una, a volte un'altra.
Per esperienza personale ho trovato che quando le varie formule concordano, il primer è buono, altrimenti il primer ha qualche difficoltà.
personalmente utilizzo il vector NTI, e questo sito che permette di confrontare più formule, una delle quali è fatta su parametri sperimentali.
http://www.promega.com/biomath/calc11.htm
In bocca al lupo
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 27 gennaio 2010 : 09:48:51
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Citazione:
Messaggio inserito da legolas
Le temperature m si possono calcolare e c'è una formula precisa.
2 X AT + 4 X GC (-5°C).
I primer non devono possedere sequenze autocomplementari.
Questa formula è vecchia come il cucco, non la usano più neanche a scuola fidati... serve solo per dare un'idea, ma è la formula meno affidabile che si conosca
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legolas
Utente
Prov.: Lecce
Città: Trepuzzi
723 Messaggi |
Inserito il - 28 gennaio 2010 : 09:08:31
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Beh non è assolutamente vero. Poi dire per una formula vecchia come un cucco non so cosa in realtà vuoi dire. In ogni caso come hai detto tu fare previsioni con i calcoli qualsiasi essi siano ti fanno avvicinare ad un risultato attendibile.
Riguardo la formula, la nostra professoressa di Biologia molecolare ce l'ha fatta studiare e portare all'esame e se non la dici e la spieghi come si deve è bocciatura assicurata. Serve a dare un idea di quale primer scegliere e non è tanto poco affidabile per come dici te. |
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Soshi Fujiwara
Nuovo Arrivato
60 Messaggi |
Inserito il - 28 gennaio 2010 : 10:59:36
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Io mi fiderei della Tm che ti fornisce la casa produttrice, ma puoi anche fare delle medie tra vari programmi.
Io ti consiglio il primer melting temerature calculation:
http://www.iit-biotech.de/iit-cgi/oligo-tm.pl
E' molto affidabile per quanto mi riguarda, ma ti consiglio di stare sempre 1-2°C sotto a quello che ti dice. |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 28 gennaio 2010 : 13:12:52
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Citazione:
Messaggio inserito da chick80
http://www.promega.com/biomath/calc11.htm
Qui trovate diverse formule, dalla più semplici e approssimativa (quella citata qui sopra) a quella "intermedia" (che considera ad es. la [sali]) a quella più complessa che considera anche lo stacking delle basi, il loro ordine etc
è lo stesso sito che ho consigliato io 
@legolas
Per la formula 2 X AT + 4 X GC (-5°C) non ho commenti, essere convinto che sia una formula necessaria per passare l'esame va bene, ma essere convinto che servi a qualcosa di pratico è ridicolo.
Quando studiate dovete riuscire a capire il senso delle cose che vi chiedono, la teoria serve a questo, nella pratica scopri giorno dopo giorno che le cose sono sempre più complesse di quelle che hai studiato superficialmente ad un esame.
Il senso della formula è capire che l'adenina e la timina formano due legami ad idrogeno, mentre la citosina e la guanina ne formano tre... tuttavia quest'ultima struttura non è 3/2 più stabile della prima, bensì il doppio. L'energia che si libera da quel legame è maggiore per diverse ragioni, tra cui la torsione del DNA, la diversa vicinanza degli idrogeni, e la diversa inclinazione delle coppie di basi. Se hai studiato biochimica sai per esempio che una sequenza continua di guanine provoca una struttura anomala del DNA, importante per fattori transcrizionali, per la forma del DNA e per la sua stabilità.
Proprio per questa ragione dovresti capire anche che se hai una sequenza GGGGGGAAAAAA ha una Tm diversa da GAGAGAGAGAGA, la tua formula, infatti, oltre a non tenere conto della %GC, non tiene conto neanche che l'alternanza delle basi GC AT in questo caso dà una differenza di stabilità di ben 4°C.
La suddetta formula non è lontanamente affidabile nè per primers piccoli, né per primers lunghi... per i primers intorno ai 20 nucleotidi si avvicina alla Tm (+/- 2-3°C quando va bene).
Se non mi credi prova a disegnare una decina di primers diversi con una sequenza di fantasia.
Poi prova a vedere la tua formula che Tm dà rispetto alle altre formule che si trovano in giro.
per avere un'idea di quello che ho scritto, se non mi credi, prova a leggerti questo articolo
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC148512/pdf/272957.pdf
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chick80
Moderatore
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Tm
Didattica
