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Vanilla Sky
Utente Junior
204 Messaggi |
 Inserito il - 01 febbraio 2010 : 09:33:40
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Ciao ragazzi, ho un esercizio da risolvere che mi suscita qualche dubbio:
“Scrivere la sequenza dei primers che useresti per amplificare questa sequenza di DNA utilizzando una reazione di PCR” (da fare a mano senza l’utilizzo di alcun software)
3’GAGCGGCCGCCCGGGCAGGTCTTAGAATTCAGCGGCCGCTGAATTCTAGGTGCTGCCGGAGACCTCAGGG
CCCCTTAAAGAGGACCCATTCCCCTGTAGACCAGTCTCTGTCCCCTGCAAGCTTTACCTGCATTCTTGCCCATG
GCGCTTCCCATTTTCTGTGTGTTCTTATCTCCCTCACTTAACTCTCTGTTCCTGTGTCTTCATTCTATGAGCTGGA
CTGAGGCCTTGGGTGGGAAAGTGGGCTCTGTATTCTATTCCGTGCCTAACCCAGCGCCTCCTTCTTGTGTCTT
TCTCCCTCTCTAGCCTATCTGGTCAGTCAGGCAACCGATCTTCCTCAGGATCATTGATCTCTGTACCTCCAGGG
GCAGTGAACCTTCCTTTCCCTGGGATAATCCTCAAGGCTCACTGATCAAACCTTTGGGCTTGGTTCACAGGTTA
GGTCTATGTCAGTACGCGACATCAGATATTTGTGTTCGTC 5’
Primer 1: (Forward) (15-35) GCAGGTCTTAGAATTCAGCG lo reverto => 5'GCGACTTAAGATTCTGGACG 3'
Primer 2: (Reverse) 3'-5' (si trova dopo 21 basi all'inizio della terz'ultima riga..mi scuso ma non sono riuscita ad evidenziarli in grassetto) GTCAGGCAACCGATCTTCCT faccio il complementare => 3'CAGTCCGTTGGCTAGAAGGA 5'
Tenendo conto dei vari criteri di scelta dei primers, ho provato a disegnarli, anche se non sono sicura della mia scelta. (Secondo voi un prodotto di circa 300 bp potrebbe andare bene per una PCR?) Potreste dare un’ occhiata ai primers e scrivere qualche suggerimento nel caso non fossero corretti? Vi ringrazio in anticipo!!!
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 01 febbraio 2010 : 16:13:39
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Citazione:
Messaggio inserito da Vanilla Sky
..mi scuso ma non sono riuscita ad evidenziarli in grassetto)
Ok ora ho modificato il tuo messaggio per evidenziarli!
Comunque i primer come li hai scritti tu sono sbagliati:
- il primer forward si attacca al filamento complementare (che è quello non codificante che non è scritto nella sequenza) e quindi la sua sequenza è uguale a quella del filamento codificante quindi:
Citazione:
Messaggio inserito da Vanilla Sky
Primer 1: (Forward) (15-35) GCAGGTCTTAGAATTCAGCG lo reverto => 5'GCGACTTAAGATTCTGGACG 3'
non devi invertirlo, lo scrivi così com'è: 5'-GCAGGTCTTAGAATTCAGCG-3'
Il primer forward invece si attacca al filamento codificante e sarà quindi "invertito" e "complementare" rispetto alla sequenza quindi:
Citazione:
Messaggio inserito da Vanilla Sky
Primer 2: (Reverse) 3'-5' (si trova dopo 21 basi all'inizio della terz'ultima riga..mi scuso ma non sono riuscita ad evidenziarli in grassetto) GTCAGGCAACCGATCTTCCT faccio il complementare => 3'-CAGTCCGTTGGCTAGAAGGA-5'
così sarebbe giusto, ma visto che le sequenze si indicano sempre da 5' a 3' devi anche invertirlo e scriverlo così: 5'-AGGAAGATCGGTTGCCTGAC-3'
Non ho guardato la temperatura di melting e gli altri parametri, comunque dici di averne tenuto conto, dovrebbe andare bene.
Citazione:
Messaggio inserito da Vanilla Sky
Secondo voi un prodotto di circa 300 bp potrebbe andare bene per una PCR?
va benissimo!
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Vanilla Sky
Utente Junior
204 Messaggi |
Inserito il - 01 febbraio 2010 : 16:31:15
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Grazie 1000 GFPina!!!
Avevo invertito il forward invece che il reverse perchè pensavo che partendo da una sequenza 3'-5' (e non 5'-3' com'ero di solito abituata)
Citazione:
3’GAGCGGCCGCCCGGGCAGGTCTTAGAATTCAGCGGCCGCTGAATTCTAGGTGCTGCCGGAGACCTCAGGG
CCCCTTAAAGAGGACCCATTCCCCTGTAGACCAGTCTCTGTCCCCTGCAAGCTTTACCTGCATTCTTGCCCATG
GCGCTTCCCATTTTCTGTGTGTTCTTATCTCCCTCACTTAACTCTCTGTTCCTGTGTCTTCATTCTATGAGCTGGA
CTGAGGCCTTGGGTGGGAAAGTGGGCTCTGTATTCTATTCCGTGCCTAACCCAGCGCCTCCTTCTTGTGTCTT
TCTCCCTCTCTAGCCTATCTGGTCAGTCAGGCAACCGATCTTCCTCAGGATCATTGATCTCTGTACCTCCAGGG
GCAGTGAACCTTCCTTTCCCTGGGATAATCCTCAAGGCTCACTGATCAAACCTTTGGGCTTGGTTCACAGGTTA
GGTCTATGTCAGTACGCGACATCAGATATTTGTGTTCGTC 5'
si facesse così. Quindi se ho capito bene sia che ho una sequenza di partenza 5'-3' o 3'-5' non inverto mai il forward, ma faccio il reverse complement del reverse?
Grazie per i chiarimenti!!! |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 01 febbraio 2010 : 17:24:06
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Citazione:
Messaggio inserito da Vanilla Sky
Grazie 1000 GFPina!!!
Avevo invertito il forward invece che il reverse perchè pensavo che partendo da una sequenza 3'-5' (e non 5'-3' com'ero di solito abituata)
 ehmmm non avevo fatto caso che la sequenza è scritta da 3' a 5'!
Puoi fare 3 cose:
1) invertirla semplicemente (cioè leggerla da 5' a 3') e disegnarti i primers su quella, in realtà quello che troverai come forward è il reverse e vice versa, ma in realtà i termini forward e reverse sono convenzioni.
2) Fare la complementare, così ottieni la sequenza 5'-3' e su quella ti disegni i primers
3) tenerla così e disegnare i primers tenendo conto di questa cosa. (cosa che io nno ho fatto)
Facciamo il terzo caso, metto solo i pezzi di sequenza dove hai scelto i primers, per il forward:
3'-GAGCGGCCGCCCGGGCAGGTCTTAGAATTCAGCGGCCGCTGAATTCTAGGTGCTGCCGGAGACCTCAGGG-5'
Mettendo anche il filamento complementare:5'-CTCGCCGGCGGGCCCGTCCAGAATCTTAAGTCGCCGGCGACTTAAGATCCACGACGGCCTCTGGAGTCCC-3'
3'-GAGCGGCCGCCCGGGCAGGTCTTAGAATTCAGCGGCCGCTGAATTCTAGGTGCTGCCGGAGACCTCAGGG-5'
Il primer forward quindi è "complementare" rispetto alla tua sequenza 3'-5' (corrisponde infatti alla sequenza 5'-3')
Quindi è: 5'-CGTCCAGAATCTTAAGTCGC- 3'
Per il primer reverse:
3'-GAGCGGCCGCCCGGGCAGGTCTTAGAATTCAGCGGCCGCTGAATTCTAGGTGCTGCCGGAGACCTCAGGG-5'
Mettendo anche il filamento complementare:
5'-AGAGGGAGAGATCGGATAGACCAGTCAGTCCGTTGGCTAGAAGGAGTCCTAGTAACTAGAGACATGGAGGTCCC-3'
3'-TCTCCCTCTCTAGCCTATCTGGTCAGTCAGGCAACCGATCTTCCTCAGGATCATTGATCTCTGTACCTCCAGGG-5'
Il primer reverse che si attacca alla sequenza 5'.3' corrisponde alla sequenza 3'-5': 3'-GTCAGGCAACCGATCTTCCT-5'
Quindi in questo caso per scriverlo da 5' a 3' lo devi "invertire": 5'-TCCTTCTAGCCAACGGACTG-3'
Adesso sono giusti! Scusa ma non mi ero proprio accorta che la sequenza fosse da 3' a 5'! |
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Vanilla Sky
Utente Junior
204 Messaggi |
 Inserito il - 01 febbraio 2010 : 17:35:12
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| Grazie!!!!Sei stata chiarissima!! |
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stella 86
Nuovo Arrivato
35 Messaggi |
Inserito il - 02 febbraio 2010 : 00:36:31
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| Scusate l'intromissione...io ho appena svolto l'esercizio e mi trovo sul disegno dei primer...praticamente all'esame il mio professore mi fa continuare l'esercizio e mi dice di effettuare una PCR..ora io mi chiedo...una volta disegnati i primer mi calcolo la temperatura di melting e poi? un'altra domanda come mi definiresti la temperatura di annealing rispetto a questo esercizio?? grazie mille e scusa l'intromissione ma il mio professore parte proprio dall'esercizio proposto da vanilla sky...grazie in anticipo |
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Vanilla Sky
Utente Junior
204 Messaggi |
Inserito il - 02 febbraio 2010 : 09:52:55
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Ciao stella 86, dunque per quanto riguarda la temperatura di anneling, ovvero la temperatura di appaiamento alla quale i primers si appaiano con il DNA stampo, la calcolerei così (è un metodo molto veloce):
Tmelting - 5°C (circa)
Perciò prendendo spunto da un primer che avevo disegnato qui sopra:
5'-TCCTTCTAGCCAACGGACTG-3'
Tmelting= (per ogni A e T segno 2°C, per ogni G e T 4°C)=> 60°C
Tannealing= Tmelting - Tannealing= 55°C
Per quanto riguarda la tua domanda Citazione:
il mio professore mi fa continuare l'esercizio e mi dice di effettuare una PCR..ora io mi chiedo...una volta disegnati i primer mi calcolo la temperatura di melting e poi?
Personalmente la imposterei così, ma non so se possa andare bene!!Descriverei la tecnica della PCR, fondata sui 3 passaggi DENATURAZIONE: TEMP. 95°C.Il DNA stampo viene denaturato;
APPAIAMENTO: 55°C CIRCA.
SINTESI: 72°C è ottimale per la Taq Polimerasi.
Specificherei la lunghezza del prodotto di PCR che ho ottenuto, e riporterei i componenti che dovrò utilizzare per fare una PCR:
il Buffer PCR, la Taq, i primers, i dNTPs, MgCl2 e acqua.
In base ai risultati che ottengo posso abbassare/aumentare la stringenza:
se ho una banda debole gioco sulla Tannealing o sul MgCl2, andando ad abbassare la stringenza;
se vedo più bande, avrò degli aspecifici=> allora aumento la T di annealing e la stringenza.
Spero di esserti stata un pò d'aiuto!!Ciao!!! |
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stella 86
Nuovo Arrivato
35 Messaggi |
Inserito il - 02 febbraio 2010 : 13:58:53
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OK..GRAZIE MILLE PER LA DELUCIDAZIONE ...C'è UN PUNTO SOLO CHE NN MI è CHIARO ..I TRE STEP DELLA PCR MI SONO CHIARI...Pero' in base ai risultati che ottengo posso abbassare/aumentare la stringenza (in che modo)???
Ho letto tutto cio' che mi ha inviato gf pina pero' vorrei degli esempi che mi aiutino a capire la pratica! GRAZIE.. |
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Vanilla Sky
Utente Junior
204 Messaggi |
Inserito il - 02 febbraio 2010 : 16:04:26
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Scusami sn stata poco chiara io, spero di non confonderti ulteriormente le idee!!
I prodotti di reazione di PCR sono analizzati mediante elettroforesi su gel di agarosio, in questo modo ci si accerta che in ogni reazione sia stato amplificato un unico prodotto (cioè che non si vedano altre bandine).
Si confrontano le dimensioni delle bande amplificate con quello del marcatore di peso molecolare noto, per confermare che il peso molecolare sia quello atteso (ecco perchè si tiene conto della lunghezza del prodotto del frammento in base ai primers che si disegnano).
L'assunto che si fa è che se la banda ha la lunghezza attesa allora probabilmente corrisponderà al frammento previsto.
Ti segnalo in questo sito una bella immagine di prodotti di PCR (ci sono 5 prodotti di PCR a cui corrispondono a 5 bande, M è il marcatore di peso molecolare noto):
http://m-biotech.co.kr/bbs/images/genomic_DNA01.jpg
Naturalmente può succedere che si ottenga una banda di diversa lunghezza rispetto all'atteso:
1.possono esserci, oltre al mio prodotto amplificato, delle altre bande, che sono aspecifiche (perchè si dovrebbe ottenere un'unica banda per ogni reazione). Ciò significa che i miei primer si sono appaiati in modo aspecifico, quindi devo aumentare la stringenza della mia reazione di PCR=> aumento la mia Tannealing (ad esempio la aumento di 5°C).
Alcuni, se non bastasse questa accortezza, diminuiscono la quantità di MgCl2 da usare nella reazione di PCR (non ho mai provato a modificare la stringenza con MgCl2). Tu ti chiederai perchè diminuisci MgCl2? Perchè la quantità di MgCl2 è inversamente proporzionale alla stringenza, perciò se abbasso la quantità=> aumento la stringenza e viceversa.Invece la Tannealing è direttamente proporzionale alla stringenza.
2.Si potrebbe formare invece una banda troppo debole come segnale, questo significa che i primers non si appaiano bene al mio DNA stampo, perchè ho una Tannealing troppo alta, quindi devo abbassare la stringenza diminuendo la Tannealing di 5°C.
Spero di essere stata un pò più chiara, molto spesso salto i passaggi più importanti,sorry!
Ciao!!!
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stella 86
Nuovo Arrivato
35 Messaggi |
Inserito il - 02 febbraio 2010 : 16:27:10
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| per astringenza intendi la lungezza dei primer che si appaiano al dna?? comunque sei stata molto chiara...grazie mille ...gentilissima! |
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Vanilla Sky
Utente Junior
204 Messaggi |
Inserito il - 02 febbraio 2010 : 17:04:02
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La stringenza rappresenta la specificità di legame tra i primers e il DNA stampo. Essa è influenzata da parametri che ti ho accennato prima (ce ne sono anche altri, ti ho elencato i principali) e anche dalla lunghezza dei primers che hai disegnato. Infatti non si disegnano mai primers troppo corti o troppo lunghi, perchè possono inficiare la specificità di legame (di solito si disegnano primers lunghi 18-22 nucleotidi circa).
Ciao!
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 02 febbraio 2010 : 17:13:58
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Citazione:
Messaggio inserito da stella 86
per astringenza intendi la lungezza dei primer che si appaiano al dna??
stringenza! (non astringenza! che significa tutt'altro che lascerei fuori dal discorso della PCR, magari consulta un vocabolario)
Comunque "stringenza" nel caso della PCR significa "specificità", abituati a questa parola perchè è molto utilizzata in Biologia Molecolare, non solo per la PCR, ad. es. anche per le sonde si più dire che sono più o meno stringenti, oppure si dice "si fanno dei lavaggi stringenti" nel senso che sono dei lavaggi abbastanza forti che lavano via tutto quello che è aspecifico.
Beh a questo punto penso tu abbia capito il discorso di Vanilla Sky, aggiungo solo un paio di cose.
La foto che ha indicato Vanilla Sky in realtà non è una PCR ma si tratta di DNA genomico che forma una banda molto grossa che migra molto lentamente sul gel, infatti si vede che è più in alto rispetto alla banda più grande dello standard, il concetto comunque è giusto, ma giusto per precisare.
Un'immagine di PCR è invece ad es. questa: http://www.aegis.org/pubs/cdc_eid/2002/EID8701-Fig2b.jpg
in 1 e 6 c'è lo standard, in 2,3 e 4 il prodotto di PCR e si vede che nel primo caso (2) si ha più prodotto, mentre in 5 c'è un controllo negativo (cioè PCR senza DNA) che di solito è bene sempre includere.
Non si vedono molto (come è giusto che sia) ma se fate caso a quelle nuvolette poco definite in fondo (nei pozzetti 2-5) sono i primers non incorporati, che si vedono nelle PCR con meno prodotto e nel controllo negativo.
Come diceva Vanilla Sky:
- Per aumentare la "stringenza" aumenti la Ta o diminuisci la concentrazione di MgCl2
- Per aumentare il prodotto diminuisci la Ta (e aggiungo) o aumenti la concentrazione di MgCl2
Consiglio comunque ad entrambe di leggervi questo: Introduzione alla PCR
spiega molte cose chiaramente e può essere utile.
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stella 86
Nuovo Arrivato
35 Messaggi |
Inserito il - 02 febbraio 2010 : 20:08:23
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Finalmente ho capito le mie lacune grazie al vostro aiuto!!
GRAZIEEEEEEEEEE |
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