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Bian Que
Nuovo Arrivato

99 Messaggi

Inserito il - 10 marzo 2010 : 20:54:49

'Sera a tutti.
Come da titolo, questo tipo di vettore mi sta dando qualche problema: non ho capito bene la formazione delle colorazioni blu o bianche..
qualcuno puo' drmi una mano..??

Dionysos
Moderatore

Citt�: Heidelberg

1913 Messaggi

Inserito il - 10 marzo 2010 : 21:17:51

Vuoi semplicemente capire il funzionamento
del sistema di white/blue screening delel colonie?

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prossima biologa
Utente Attivo

1437 Messaggi

Inserito il - 10 marzo 2010 : 22:19:47

il pUC19 � un vettore plasmidico. i plasmidi sono molto utilizzati nella clonazione di inserti di DNA. ESISTE un sito di polilinker presente all'interno del gene della b-galattosidasi di tale plasmide. capirai quindi che se inserisco un frammento di DNA esogeno nel vettore in questo sito di polilinker, il gene della b-galattosidasi viene interrotto, mentre se l'inserzione (ligation) non riesce, il gene della b-galattosidasi non viene interrotto e tale enzima pu� esser sintetizzato. Detto ci� la colorazione (screening blue/white) � importante perch� nel clonaggio tu dovresti fare la ligation(questa reazione di inserire il DNA nel vettore) poi dovresti trasformare le cellule batteriche (per esempio e.coli) e selezionare quelle che hanno il vettore e di queste quelle che hanno l'inserto. il processo � lungo e selettivo ma grazie allo screening blue/white tu puoi subito vedere quali cellule hannoil plasmide puc19 con l'inserto di DNA. si piastrano le cellule trasformate e aggiungi alla piastra X-gal e IPTG questi 2 prodotti sono un substrato della b-galattosidasi(che quindi pu� essere scisso da tale enzima) e un altro composto che dar� la colorazione se avviene la reazione. Se l'inserto non � presente viene sintetizzata la b-galattosidasi e le colonie saranno blu. se � presente l'inserto l'enzima b-galattosidasi non viene sintetizzato,, x-gal non viene scisso e le colonie saranno bianche. selezionando le colonie bianche potr� procedere a selezionare i cloni dell'inserto e magari amplificarli.

chiaro ?

Aiuto in biochimica?guarda qui
Info sul lavoro di biologo?guarda qui

laviadellavirtu
Nuovo Arrivato

51 Messaggi

Inserito il - 10 marzo 2010 : 22:52:46

Buona sera a tutti...la spiegazione di "prossima Biologa" � stata sufficiente...
se proprio dovremmo essere piu corretti...
Cara Bian Que questo sistema di screening potrebbe risultati un ottimo sistema di screening per capire se ho clonato il mio frammento o meno...
in realta...a volte il frammento viene clonato nel corretto frame e questo vuol dire che la beta galattosidasi rimarra' ancora attiva e le colonie appariranno blu invece che bianche...
e allora ecco che vengono in soccorso dei metodi di screening piu efficaci...come la colony hybridation...ciao a tutti.

prossima biologa
Utente Attivo

1437 Messaggi

Inserito il - 12 marzo 2010 : 15:45:01

giusto... ottima osservazione "laviadellavirtu"

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fera85
Nuovo Arrivato

1 Messaggi

Inserito il - 09 novembre 2010 : 10:05:01

Avrei una domanda aggiuntiva: lavorando con questo sistema di screening su piastra non trovo solo colonie bianche e blu, ma anche colonie bianche con al centro un puntino blu, che ovviamente tende ad aumentare man mano che la colonia cresce...cosa potrebbe esser successo?Il frammento c'� o non c'�?

Thanks in anticipo per le risposte!